本发明专利技术涉及使用存在于被杀死的微生物中的DNA片段作为标签来确认物品或产品的身份的方法。在一些实施方案中，选择含有待标记物品中不存在的靶核苷酸序列的食品相容性微生物作为标签，然后在数据库中为所述标签保存所述物品的身份唯一标识符和/或其他元数据。杀死微生物以产生具有靶核苷酸序列的标签，并将标签添加到物品中。随后，通过提取物品中的DNA并使用PCR技术扩增一个或多个靶核苷酸序列，对每个扩增的靶核苷酸序列进行测序，然后将它们与为靶核苷酸序列保存的核苷酸序列进行比较，可以确认物品的身份。
本专利技术的一个或多个实施方案涉及用于追踪产品(例如食品、农业产品、个人护理产品、化妆品和医药产品)的方法。在某些实施方案中，本专利技术涉及在供应链中使用通过加热、辐照或其他食品级杀死方法杀死的微生物作为标记物，进行追踪产品(例如食品、农产品、个人护理产品、化妆品和医药产品)的各种方法，以及用于检测这些标记物的相关方法。
1、随着供应链变得越来越大和范围越来越全球化，有必要精确追踪货物的来源，以确保物品或产品的真实性和完整性。确保真实性和完整性的能力对于摄入、吸入或涂抹在人类和动物皮肤上的产品尤为重要。对于食品和饲料来说，这通常是正确的，在转基因食品被禁止的国家，或者特殊食品方案占主导地位的国家，如清真食品和犹太食品，情况更是如此。
2、虽然集装箱可以用条形码或rfid标签以及其他追踪和追溯手段进行标记，但其中所含产品的真实性和完整性无法保证，因为它们可能在运输或储存过程中被换掉或掺假。因此，已经进行了许多尝试来尝试标记产品本身。
3、已经提出了不同的方案，涉及使用dna进行标记以编码产品的起源；但已发现这些具有严重的局限性。目前大多数可用方案的问题是，dna不是天然来源的，需要封装，这在关键应用中可能是有害的，独特的标识符的范围是有限的，它们不允许在一个产品中检测多个标签和/或信噪比过高。
4、本领域所需要的是一种安全的、食品相容(例如gras)的、天然的和稳定的标记系统，可扩展以允许使用大量独特的标识符进行标记，允许对产品进行批次等级鉴定，并检测单个产品中的多个标签。
r/>技术实现思路
0、专利技术概述
1、在一个或多个实施方案中，本专利技术涉及一种安全的、食品相容的、天然的和稳定的标记系统，可扩展以允许使用大量独特的标识符进行标记，允许对产品进行批次等级鉴定，并检测单个产品中的多个标签。微生物在其基因组dna序列中提供了几乎无限量的变异。如果对这种多样性进行了适当的表征，则可以基于产品中天然不存在的微生物独特的序列来定义独特的标识符，从而能够对产品或装运批次进行追踪和追溯。菌株标识符和标签序列等存储在数据库中，以便以后比较。如有必要，可以通过使用天然和食品相容的(例如gras)诱导自然序列变异过程来产生更多的序列多样性。
2、由于微生物具有活跃的代谢，可能对物品或产品产生不利影响，无论如何，在将微生物添加到物品或产品中之前杀死微生物至关重要。显而易见，杀死微生物不会破坏作为标签的微生物的dna。许多微生物具有强大的细胞壁，可以保护微生物的细胞，包括细胞中含有的dna。在一些实施方案中，已发现本文所述的用于杀死微生物的程序可以可靠地杀死70％至100％的细胞，同时在原位保留部分或全部细胞壁以保护细胞中的dna。(参见美国专利申请公开号2005/0180962a1，其全部公开内容通过引用并入本文)。
3、这些被杀死的微生物的基因组核苷酸序列已经被表征并且是已知的，将其与其他已知基因组核苷酸序列的一个或多个数据库进行比较，以鉴定独特的核苷酸序列，或者鉴定在任何情况下，与被标记的物品或产品中存在的序列不同的序列。这些序列(在本文中通常称为“靶序列”)用作独特的标签，并被记录和保存在数据库、电子表格、分类账、区块链或其他类似系统中，并在其中链接到鉴定和/或将由标签代表的其他信息。显而易见，这些标签中的每一个都可以用这种方式来鉴定物品的任何方面或其来源。在各种实施方案中，靶序列“标签”可以与不同类型的元数据相关联，所述元数据包括但不限于这样的事物如分配的独特标识符编号(uid)、制造商的名称和位置、装运信息(原产地、行程、目的地信息)、装运元数据(温度、包装等)、批号、生产日期、到期日期、来源、一个或多个分销商的名称和位置、生产方法、一个或多个被许可人的名称和位置、关键质量参数、关键工艺参数、制造或生长条件、地理起源/出处、气候信息、环境信息、农药和其他农业实践的使用、其他种植者元数据、无过敏原状态、清真/犹太/有机状态、无转基因状态、公平贸易状态、监管批准状态(例如，usda或fda批准状态)、其他消费者信息及其组合。然后将含有“标签”的杀死微生物添加到物品或产品中，然后可以使用pcr和/或dna测序进行检索和检测，以确定标记的物品或特定产品的身份。
4、此外，该过程允许同时检测产品中的多个标记物，从而可以同时追踪复合产品中许多成分的来源。这允许用户检测跨批次污染，特别适用于追踪和追溯消费者产品，其中原始产品经历多个复合步骤，并独立追溯复合产品中的单个成分。
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【技术保护点】
1.通过食品相容的微生物标签确认物品或产品身份的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述食品相容的微生物是益生菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述食品相容的微生物是选自由厚壁菌门(乳酸杆菌属)、放线菌门(双歧杆菌属)及其组合组成的组的细菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，食品相容的微生物是选自由动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)(BB12)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)(LMG 11041)、长双歧杆菌(ATCC 15708)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.Infantis)(LMG 8811)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)(ATCC 6057)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(ATCC 4356)、干酪乳杆菌(Lactocaseibacilluscasei)(ATCC 393)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus)(ATCC11842)、副干酪乳杆菌(Lactocaseibacillus paracasei)(DSM 5622)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)(ATCC 8014)、鼠李糖乳杆菌(Lactocaseibacillusrhamnosus)(ATCC 53103)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)(ATCC11741)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(ATCC 19435)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)(LMG 9213)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)(ATCC 15807)和其组合组成的组的细菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个靶核苷酸序列是长度为约20至5000个碱基对的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个靶核苷酸序列基本上包含所述食品相容的微生物中的所有所述基因组DNA和/或质粒DNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，保存步骤(步骤B)包括将被选作标签的一个或多个靶核苷酸序列和待标记物品的身份保存在保存于非短暂性计算机存储器中的本地或基于云的数据库中，并且比较步骤(步骤E4)是使用在计算机或其他微处理器上运行的基本本地比对搜索工具(BLAST)算法来进行的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述数据库存储在区块链上。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，杀死步骤(步骤B)包括在约60℃至约138℃的温度下孵育所述食品相容的微生物约0.01至约30分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，杀死步骤(步骤B)包括用伽马辐射照射所述食品相容的微生物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，杀死步骤(步骤B)包括用约5千戈瑞(kGy)至约50kGy的伽马辐射照射所述食品相容的微生物约15秒至约48小时。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，杀死步骤(步骤B)包括用X射线照射所述食品相容的微生物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，杀死步骤(步骤B)包括用约20千戈瑞至约40千戈瑞的X射线照射所述食品相容的微生物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，在杀死步骤(步骤B)之后，食品相容的微生物的细胞壁基本上是完整的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中添加步骤(步骤D)包括向物品添加两个或多个不同的标签。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，提取步骤(步骤E1)是通过乙醇沉淀和在Tris-EDTA(TE)缓冲液中溶解进行的。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，提取步骤(步骤E1)是使用离心柱并在洗脱缓冲液中洗脱DNA进行的。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述添加引物的步骤(步骤E2)中，引物是通过固相寡核苷酸合成而形成的。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，使用Sanger测序或靶向下一代测序(tNGS)技术进行扩增靶核苷酸序列的测序步骤(步骤E3)。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，比较步骤(步骤E.4)是使用BLAST或类似算法进行的。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述产品是食品、农产品、个人护理产品、化妆品或药品。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.通过食品相容的微生物标签确认物品或产品身份的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述食品相容的微生物是益生菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述食品相容的微生物是选自由厚壁菌门(乳酸杆菌属)、放线菌门(双歧杆菌属)及其组合组成的组的细菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，食品相容的微生物是选自由动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)(bb12)、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)(lmg 11041)、长双歧杆菌(atcc 15708)、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongum subsp.infantis)(lmg 8811)、屎肠球菌(enterococcus faecium)(atcc 6057)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)(atcc 4356)、干酪乳杆菌(lactocaseibacilluscasei)(atcc 393)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(lb.delbrueckii subsp.bulgaricus)(atcc11842)、副干酪乳杆菌(lactocaseibacillus paracasei)(dsm 5622)、植物乳杆菌(lactiplantibacillus plantarum)(atcc 8014)、鼠李糖乳杆菌(lactocaseibacillusrhamnosus)(atcc 53103)、唾液联合乳杆菌(ligilactobacillus salivarius)(atcc11741)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)(atcc 19435)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)(lmg 9213)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)(atcc 15807)和其组合组成的组的细菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个靶核苷酸序列是长度为约20至5000个碱基对的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个靶核苷酸序列基本上包含所述食品相容的微生物中的所有所述基因组dna和/或质粒dna。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，保存步骤(步骤b)包括将被选作标签的一个或多个靶核苷酸序列和待标记物品的身份保存在保存于非短暂性计算机存储器中的本地或基于云的数据库中，并且比较步骤(步骤e4)是使用在计算机或其他微处理器上运行的基本本地比对搜索工具(blast)算法来进行的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述数据库存储在区块链上。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，杀死步骤(步骤b)包括在约60℃至约138℃的温度下孵育所述食品相容的微生物约0.01至约30分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，杀死步骤(步骤b)包括用伽马辐射照射所述食品相容的微生物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，杀死步骤(步骤b)包括用约5千戈瑞(kgy)至约50kgy的伽马辐射照射所述食品相容的微生物约15秒至约48小时。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，杀死步骤(步骤b)包括用x射线照射所述食品相容的微生物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，杀死步骤(步骤b)包括用约20千戈瑞至约40千戈瑞的x射线照射所述食品相容的微生物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，在杀死步骤(步骤b)之后，食品相容的微生物的细胞壁基本上是完整的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中添加步骤(步骤d)包括向物品添加两个或多个不同的标签。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，提取步骤(步骤e1)是通过乙醇沉淀和在tris-edta(te)缓冲液中溶解进行的。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，提取步骤(步骤e1)是使用离心柱并在洗脱缓冲液中洗脱dna进行的。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述添加引物的步骤(步骤e2)中，引物是通过固相寡...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢卡斯·A·穆勒，香塔尔·罗斯，
申请(专利权)人：示迹科技私人有限公司，
类型：发明
国别省市：
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