【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种非天然硒基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硒酸的合成方法，属于生物工程。
技术介绍
1、硒(se)是一种生命活动必需的微量营养元素，主要以硒代有机物的形式存在于生物机体中，并参与重要的生理过程。由于硒具有营养学和毒理学作用，在营养健康和生物医药领域受到了广泛关注。随着人们对健康、营养需求的快速提升，在食品和膳食补充剂中主要以硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、硒多糖等作为se补充的重要来源。然而自然界低丰度的硒源，含硒天然产物和硒掺入酶系在大自然中并不常见。并且，硒代有机物的生物合成酶系缺乏和机制仍不清晰，严重制约了其广泛挖掘与应用研究。
2、已知3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，paps)作为硫酸根基团供体用于由多种磺基转移酶催化的所有生物硫酸化反应。paps可通过腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(atps)、腺苷5′-磷酸硫酸激酶(apsk)和paps合成酶(papss)将atp硫酸化和磷酸化而合成的。由于硒与硫元素化学性质极其类似，硫代谢酶系对s和se底物的分辨能力较差，展现了较好的底物杂泛性。因此从自然界中挖掘具备硒转移功能的酶系，并实现酶的重组表达，为非天然硒基活性供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硒酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphoselenate，papse)的制备提供理想的生物合成路径，进一步为硒代有机物的生物合成奠定理论技术基础。
3、当前报道的3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶(hpap
技术实现思路
1、[技术问题]
2、自然界低丰度的硒源，以及含硒天然产物和硒掺入酶系在大自然中并不常见，因此硒代有机物的生物合成酶系缺乏和机制仍不清晰，严重制约了其广泛挖掘与应用研究。此外，hpapss1的中间产物的抑制作用未得到较大改善，无法应用到papse的工业化生产。
3、[技术方案]
4、本专利技术提供一种提高hpapss1催化性能的分子改造方法，即基于半理性设计，通过点饱和突变技术解除apse对hpapss1的底物抑制作用，获得具有高apse亲和力及papse转化率的突变体酶。本专利技术构建的突变体具有良好的催化特性，对于促进papse的绿色、高效合成具有重要意义。
5、本专利技术的第一个目的是提供一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶(hpapss1)突变体，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no.1所示的野生酶的基础上，将第109位和/或第133位进行突变。
6、在一种实施方式中，所述第109位的突变是在氨基酸序列如seq id no.1所示的野生酶的基础上，将第109位天门冬酰胺突变为精氨酸，得到氨基酸序列如seq id no.2所示的突变体hpapss1-n109r。
7、在一种实施方式中，所述第133位的突变是在氨基酸序列如seq id no.1所示的野生酶的基础上，将第133位的丝氨酸突变为谷氨酸，得到氨基酸序列如seq id no.3所示的突变体hpapss1-s133e。
8、本专利技术的第二个目的是提供编码所述hpapss1突变体的基因。
9、本专利技术的第三个目的是提供表达所述hpapss1突变体或含有上述基因的表达载体。
10、本专利技术的第四个目的是提供含有上述hpapss1突变体或上述表达载体的重组菌。
11、在一种实施方式中，所述的重组菌以大肠杆菌为宿主。
12、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括bl21(de3)。
13、在一种实施方式中，所述的重组菌的表达载体包括pet系列载体。
14、在一种实施方式中，所述的重组菌的表达载体包括pet-28a。
15、本专利技术的第五个目的是提供一种合成非天然硒基活性供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硒酸(papse)的方法，所述方法为将hpapss1或所述突变体与硒供体和atp混合，合成papse。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述硒供体包括但不限于硒酸盐、亚硒酸盐、磷酸硒、硒化氢；所述硒酸盐包括但不限于硒酸镁、硒酸钠、硒酸钾。
17、在本专利技术的一种实施方式中，硒酸盐可优选为硒酸钠。
18、在本专利技术的一种实施方式中，在反应体系中加入底物atp和硒酸钠及氯化镁，随后加入hpapss1进行催化反应，并在催化反应全程每隔3h补加等量atp。
19、在本专利技术的一种实施方式中，以终浓度计，反应体系中缓冲溶液为10～50mmtris-hcl，ph为6.0～8.0，添加2～20mm atp、1～10mm氯化镁、1～100mm硒酸钠，加入hpapss1酶0.8～1.0mg/ml。
20、在本专利技术的一种实施方式中，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为8～20h。
21、在本专利技术的一种实施方式中，催化体系添加保护剂bsa 0.1～0.2mg/ml。
22、本专利技术还保护所述3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶突变体，或3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶(hpapss1)在制备papse或以papse为原料的产品中的应用。
23、[有益效果]
24、本专利技术借鉴paps合成路径首次通过hpapss1实现了非天然硒基活性供体papse的生物合成。通过对hpapss1的apse底物结合相关位点的改造，成功获得了催化性能提高的突变体。相较于原始酶hpapss1，突变体hpass1-n109r和hpass1-s133e的比酶活比野生型分别提高1.31倍和1.65倍；papse转化率较野生型hpapss1(32％)分别提高至57％和64％。本专利技术为硒代有机物的生物合成开辟新路径和奠定理论技术基础。
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1.一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生酶的基础上，进行第109位和第133位的至少一种突变。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述第109位的突变为将第109位天门冬酰胺突变为精氨酸；所述第133位的突变为将第133位的丝氨酸突变为谷氨酸。
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.含有权利要求1或2所述突变体或权利要求4所述表达载体的重组菌。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。
7.一种酶法合成非天然硒基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硒酸的方法，其特征在于，向反应体系中添加底物和催化剂，进行反应；所述底物包括ATP和硒供体；所述催化剂包括3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶或权利要求1或2所述突变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述硒供体包括但不限于硒酸盐、亚硒酸盐、磷酸硒、硒化氢；所述硒酸盐包括但不限于硒酸镁、硒酸钠
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，于20～40℃，反应至少1h；可选地，所述反应体系中含有：Tris-HCl 10～50mM，ATP-Na 2～20mM，Na2SeO4 1～100mM，氯化镁1～10mM，3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶0.8～1.0mg/mL，BSA0.1～0.2mg/mL。
10.权利要求1或2所述3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶突变体，或3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶在制备3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硒酸或含3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硒酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no.1所示的野生酶的基础上，进行第109位和第133位的至少一种突变。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述第109位的突变为将第109位天门冬酰胺突变为精氨酸；所述第133位的突变为将第133位的丝氨酸突变为谷氨酸。
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.含有权利要求1或2所述突变体或权利要求4所述表达载体的重组菌。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。
7.一种酶法合成非天然硒基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硒酸的方法，其特征在于，向反应体系中添加底物和催化剂，进行反应；所述底物包括atp和硒供体；...
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