【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及一种工程化外泌体及其制备方法和在制备预防流产和促进胎儿发育的药物中的应用。
技术介绍
1、流产是最常见的生殖障碍之一，被定义为怀孕20-24周前的妊娠失败。据估计，全球每年发生约2300万起流产，在所有已知妊娠风险中占15.3％。胎儿被视为同种异体移植物，母胎免疫稳态在妊娠中发挥至关重要的作用。母胎界面中自然杀伤细胞(nk细胞)和巨噬细胞是最丰富的免疫细胞亚群，在免疫细胞中占比分别为70％和20％。正常妊娠中子宫蜕膜nk细胞和巨噬细胞大量浸润和富集有利于母胎免疫耐受的建立、滋养层细胞的侵袭以及螺旋动脉重铸，并进一步满足胎儿代谢需求、促进胎儿生长发育，最终维持正常妊娠。然而，毒性nk细胞和促炎型m1型巨噬细胞的过度激活和富集可能导致流产。研究显示，流产患者子宫中促炎型cd16+nk细胞亚群显著积聚；并且nk细胞过度分泌tnf-α和ifn-γ会抑制滋养层细胞的迁移侵袭能力，以及基质细胞的蜕膜化，最终导致流产。此外，流产患者中巨噬细胞分泌过多tnf-α会阻碍滋养层细胞的侵袭；并且m1型巨噬细胞fasl的表达增加或一氧化氮合酶活性降低会导致滋养层细胞凋亡。
2、目前临床上针对子宫免疫细胞比例异常或毒性升高，采用的免疫抑制剂主要有糖皮质激素(glucocorticoid，gc)。尽管体外实验表明这类免疫抑制剂可抑制nk细胞毒性及炎症因子的表达，促使巨噬细胞往免疫耐受表型极化，但在临床上其治疗仅表现为部分患者有效。此外，口服药物后，药物随血液流经全身，对全身大部分脏器、细胞均有作用；长期用药
3、工程化外泌体粒径为纳米级别，属于天然载药纳米颗粒，由于高生物相容性，工程化外泌体在医学领域被广泛研究。在肿瘤和组织修复等领域，工程化外泌体被报道可靶向免疫细胞调控组织免疫微环境稳态，改善病征。nk细胞来源的外泌体负载顺铂后可以增加耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，激活nk细胞毒性，促进对癌细胞的杀伤作用。m1型巨噬细胞来源的外泌体表面修饰il-4r结合肽段并负载nf-κb p50 sirna和mir-511-3p促使肿瘤相关巨噬细胞往m1型巨噬细胞极化，抑制肿瘤进展。表面修饰as1411核酸适体的巨噬细胞外泌体可以穿透血脑屏障，增加对胶质瘤细胞的靶向作用，同时外泌体内部装载过氧化氢酶通过催化过氧化氢产生氧气缓解肿瘤缺氧环境，增强声动力对肿瘤的杀伤作用。鉴于载药纳米颗粒在生殖医学领域中的应用前景及工程化外泌体高生物相容性的优势，本专利技术拟通过构建工程化外泌体，获得流产疾病中精准且安全的gc给药平台，通过靶向子宫蜕膜cd16+免疫细胞，调整免疫稳态，改善妊娠结局。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种工程化外泌体及其制备方法和在制备预防流产和促进胎儿发育的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本专利技术提供的工程化外泌体能够精准且安全将gc传送到靶细胞上，同时还能减少药物剂量，有助于降低药物全身性副作用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供了一种工程化外泌体，所述工程化外泌体包括包裹糖皮质激素的外泌体和抗cd16抗体。
4、优选的，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
5、优选的，所述糖皮质激素为甲泼尼龙琥珀酸钠。
6、本专利技术提供了上述的工程化外泌体的构建方法，包括以下步骤：
7、将外泌体和糖皮质激素混合，进行超声处理，得到包裹糖皮质激素的外泌体溶液；
8、将包裹糖皮质激素的外泌体溶液和二苄环辛基-磺基-n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，得到带有dbco基团的exo-gc；
9、将抗cd16抗体和azide-sulfo-nhs混合，得到叠氮基修饰的抗cd16抗体溶液；
10、将带有dbco基团的exo-gc和叠氮基修饰的抗cd16抗体溶液混合，得到所述工程化外泌体。
11、优选的，所述超声处理的条件参数为：20％振幅；以开30秒、关30秒为1次循环，共循环6次，每次循环之间间隔冷却2min。
12、优选的，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体；所述糖皮质激素为甲泼尼龙琥珀酸钠。
13、优选的，所述包裹糖皮质激素的外泌体溶液中外泌体的终浓度为500μg/ml，糖皮质激素的终浓度为250-1000μg/ml。
14、优选的，所述包裹糖皮质激素的外泌体和二苄环辛基-磺基-n-羟基琥珀酰亚胺酯的微粒数和摩尔数比为1013个：40nmol；
15、所述叠氮基修饰的抗cd16抗体溶液中抗cd16抗体的终浓度为2μm，azide-sulfo-nhs的终浓度为20μm。
16、优选的，所述带有dbco基团的exo-gc和叠氮基修饰的抗cd16抗体的微粒数和摩尔数比为1013：20nmol。
17、本专利技术提供了上述的工程化外泌体在制备预防流产和促进胎儿发育的药物中的应用。
18、本专利技术公开了以下技术效果：
19、本专利技术提供一种工程化外泌体，所述工程化外泌体包括包裹糖皮质激素的外泌体和抗cd16抗体。外泌体根据来源细胞的类型和组织类别，具有一定的同源组织靶向能力。并且，胎盘包括脐带以及其来源的外泌体不会引发炎症反应并且可以逃避母体免疫系统的清除。此外，脐带来源的间充质干细胞外泌体具有对子代安全的绝对优势。前期专利技术人也发现，脐带间充质干细胞来源的外泌体可自发富集在未孕或怀孕的宫腔局部。鉴于以上特性，本专利技术利用脐带间充质干细胞来源的外泌体作为载体，通过超声技术负载gc，并通过点击化学的方法在外泌体表面修饰靶向cd16的抗体，该工程化外泌体(gc-exo-cd16ab)经血液流通后富集到宫腔局部，并通过抗原抗体反应靶向cd16+免疫细胞，通过膜融合或内吞的方式，释放gc并作用于靶细胞，极大减少gc对非靶组织、非靶细胞的毒副作用。本专利技术工程化外泌体可有效抑制nk细胞的细胞毒性，促进m1型巨噬细胞往m2型巨噬细胞极化，抑制蜕膜细胞凋亡，促进胎儿生长发育，有效减轻流产。综上可知，本专利技术构建母胎局部精准给药系统，为流产及妊娠相关疾病的预防和治疗提供新的策略。
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1.一种工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体包括包裹糖皮质激素的外泌体和抗CD16抗体。
2.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
3.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其特征在于，所述糖皮质激素为甲泼尼龙琥珀酸钠。
4.权利要求1所述的工程化外泌体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述超声处理的条件参数为：20％振幅；以开30秒、关30秒为1次循环，共循环6次，每次循环之间间隔冷却2min。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体；所述糖皮质激素为甲泼尼龙琥珀酸钠。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述包裹糖皮质激素的外泌体溶液中外泌体的终浓度为500μg/mL，糖皮质激素的终浓度为250-1000μg/mL。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述包裹糖皮质激素的外泌体和二苄环辛基-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯的微粒数和摩
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述带有DBCO基团的Exo-GC和叠氮基修饰的抗CD16抗体的微粒数和摩尔数比为1013：20nmol。
10.权利要求1-3任一项所述的工程化外泌体在制备预防流产和促进胎儿发育的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体包括包裹糖皮质激素的外泌体和抗cd16抗体。
2.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
3.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其特征在于，所述糖皮质激素为甲泼尼龙琥珀酸钠。
4.权利要求1所述的工程化外泌体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述超声处理的条件参数为：20％振幅；以开30秒、关30秒为1次循环，共循环6次，每次循环之间间隔冷却2min。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体；...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琳琳，李龙飞，冯刚，陈现，孙青，刁梁辉，尹太郎，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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