【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，特别涉及一种氯霉素均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法。
技术介绍
1、氯霉素是一种广谱抗生素，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用；其抗菌作用机制是通过可逆地与50s亚基结合，抑制肽酰基转移酶，干扰带有氨基酸的胺基酰-trna终端与50s亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，特异性阻止mrna与核糖体的结合，抑制蛋白质合成。敏感菌有大肠杆菌、产气杆菌、伤寒杆菌、流感杆菌、沙门菌、布氏杆菌、巴氏杆菌、克雷伯杆菌、胎孤菌，抑菌浓度在1-10μg/ml；在高药物浓度时对某些细菌亦可产生杀菌作用，对流感杆菌甚至在较低浓度时即可产生杀菌作用。自1948年上市以来一直是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏菌病的首选药物。因氯霉素效高价廉易获得，在医学和畜牧业中广为应用。氯霉素对人和动物的骨髓细胞、肝细胞具有毒性作用,引起与剂量有关的可逆骨髓抑制及与剂量无关的不可逆的再生障碍性贫血。细菌对氯霉素有发展缓慢的耐药性，长期微量摄入不仅使沙门氏菌、大肠杆菌等产生耐药性，还会引起机体菌群失调，使人们易患各种疾病。
2、氯霉素内服吸收良好，注射较缓慢；吸收后全身分布，并能透过血一脑和胎盘屏障。大部分氯霉素在肝中与葡萄糖酸结合而失活，约10％以氯霉素原化合物形式经肾排泄，亦能通过乳汁分泌。或通过尿液或粪便排入环境中，长期富集、去除不足和化学稳定性高的情况下，氯霉素也经常在不同的水环境中被检测到。包括地表水、地下水以及上游和下游河流故氯霉素的检测需求主要是人血药浓度监测、食用动物的可食部分及农副产品残留检测和城市污水检测。p>
3、目前氯霉素的检测方法较多，常见的有容量法、紫外可见分光光度法、化学发光法、量子点荧光法、高效液相色谱法等。但这些检测方法操作复杂、耗时长，不能满足临床治疗药物监测和畜牧、农副产品的日常质检和城市污水监测对于高通量、快速化的要求。因此，亟需获得一种新的、高效、快速的氯霉素检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种满足检测快筛需求，特异性强、稳定性好、结果准确、可应用于全自动生化分析仪的氯霉素均相酶免疫检测技术的氯霉素均相酶免疫检测试剂。
2、本专利技术的第二目的在于提供上述氯霉素均相酶免疫检测试剂的制备方法。
3、本专利技术的第三目的在于提供上述氯霉素均相酶免疫检测试剂的应用。
4、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
5、一种氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物，其结构式如式(ⅰ)所示：
6、
7、式中y为-co-(ch2)n-co-，其中n为1～10的任意整数。
8、进一步地，所述的氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物，其结构式如式(ⅱ)所示：
9、
10、上述氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物的制备方法，包括以下步骤：
11、(1)在三颈瓶中加入丙酮、有机酸酐化合物和三乙胺水浴加热搅拌至溶液澄清，再将氯霉素溶解在反应液中，反应，浓缩，纯化得到氯霉素衍生物；
12、(2)将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)加入至含有nacl和mgcl2的tris缓冲液中；再加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷(nadh)、葡萄糖-6-磷酸(g6p)，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
13、(3)氯霉素衍生物溶液的制备：将步骤(1)制备的氯霉素衍生物溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，常温搅拌混匀，得到氯霉素衍生物溶液；
14、(4)氯霉素酶标偶联物的制备：将步骤(3)得到的氯霉素衍生物溶液逐滴加入到步骤(2)得到的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，搅拌反应，经凝胶层析柱纯化，得到氯霉素酶标偶联物(cap-g6pd)。
15、进一步地，步骤(1)中所述的有机酸酐化合物和氯霉素的摩尔比为：1:2。
16、进一步地，步骤(1)中所述的有机酸酐化合物、氯霉素和三乙胺的摩尔比为：1.5:3:1。
17、进一步地，步骤(1)中所述的丙酮的加入量为能溶解有机酸酐化合物的量，更进一步为每2g有机酸酐化合物加入25ml丙酮。
18、进一步地，步骤(1)中所述的有机酸酐化合物为不同链长的环状酸酐，更进一步为琥珀酸酐、戊二酸酐或己二酸酐；再更进一步为己二酸酐。
19、进一步地，步骤(1)中所述的纯化为快速色谱法纯化。
20、进一步地，步骤(1)中所述的反应为50℃下反应回流搅拌过夜。
21、进一步地，步骤(1)中所述的反应式如式(ⅲ)所示：
22、
23、x为-co-(ch2)n-cooh；n为1～10的任意整数；x-a为对应的有机酸酐化合物；
24、更进一步地，步骤(1)中所述的反应式如式(ⅳ)所示：
25、
26、进一步地，步骤(1)中所述的氯霉素衍生物如式(ⅴ)所示：
27、
28、x为-co-(ch2)n-cooh；n为1～10的任意整数；
29、更进一步地，步骤(1)中所述的氯霉素衍生物如式(ⅵ)所示：
30、
31、进一步地，步骤(2)中所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中g6pd的浓度为8～10nmol/ml；更进一步为9.3nmol/ml。
32、进一步地，步骤(2)中所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中nadh和g6pd的摩尔比为10:1。
33、进一步地，步骤(2)中所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中g6p和g6pd的摩尔比为50:1。
34、进一步地，步骤(2)中所述的含有nacl和mgcl2的tris缓冲液中mgcl2的浓度为0.5～1.5mmol/l，nacl的浓度为0.05～0.15mol/l；更进一步地，中所述的含有nacl和mgcl2的tris缓冲液中mgcl2的浓度为1mmol/l，nacl的浓度为0.1mol/l。
35、进一步地，步骤(3)中所述的氯霉素衍生物、edc和nhs的物质的量比例为1:1～1.5:1～1.5；更进一步为1:1:1。
36、进一步地，步骤(3)中所述的dmf的加入量为能溶解氯霉素衍生物的量；更进一步为每1mol氯霉素衍生物加入300μl dmf。
37、进一步地，步骤(3)中所述的搅拌混匀为搅拌4～8h；更进一步为搅拌6h。
38、进一步地，步骤(4)中所述的g6pd与氯霉素衍生物物质的量比为1:6.25～100；更进一步为1:12.5。
39、进一步地，步骤(4)中所述的搅拌反应为2℃搅拌反应过夜。
40、一种氯霉素均相酶免疫检测试剂，包括r1试剂和r2试剂；
41、所述的r1试剂包括抗氯霉素特异性抗体和均相酶底物溶液；
42、所述的r2试剂包括上本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
2.根据权利要求1所述的氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物，其特征在于，其结构式如式(Ⅱ)所示：
3.权利要求1或2所述的氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
6.一种氯霉素均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂；
7.根据权利要求6所述的氯霉素均相酶免疫检测试剂，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的氯霉素均相酶免疫检测试剂，其特征在于，
9.权利要求6～8任一项所述的氯霉素均相酶免疫检测试剂在检测氯霉素中的应用。
10.一种使用权利要求6～8任一项所述的氯霉素均相酶免疫检测试剂检测样品中氯霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物，其特征在于，其结构式如式(ⅰ)所示：
2.根据权利要求1所述的氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物，其特征在于，其结构式如式(ⅱ)所示：
3.权利要求1或2所述的氯霉素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
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