【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物，具体涉及一种产气荚膜梭菌的分离和鉴定方法。
技术介绍
1、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens，cp)曾称魏氏梭菌或产气荚膜杆菌，是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气荚膜梭菌。产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎。产气荚膜梭菌形成的毒性物质有12种，可损伤细胞膜、血管内皮细胞并使糖类分解，导致细胞坏死、组织水肿、充气等病变。根据产生毒素种类和致病性的不同，产气荚膜梭菌有a、b、c、d、e、f6个型。
2、目前，在实验室分离产气荚膜梭菌时，常用的方法有血琼脂平板划线分离法、sps平板法、tsc-卵黄平板法、cw平板法等，产气荚膜梭菌为厌氧菌，且对厌氧要求较为严格，对培养基要求也较高，该菌在不同的培养基上表现出不同的生长特性。
3、产气荚膜梭菌在5％绵羊血琼脂平板上，呈现带有双溶血环的菌落形态，内层完全溶血，外层不完全溶血，似靶状。但该培养基无选择性，对革兰氏阴性菌无抑制作用，不利于从污染的病料或肠内容物中分离产气荚膜梭菌。sps平板可对某些厌氧菌或兼性厌氧菌有抑制作用而具有一定的选择性，这种培养基含铁和亚硫酸盐，产气荚膜梭菌可使亚硫酸盐还原成硫化物，产生黑色菌落，然而，少数产气荚膜梭菌不能在sps平板上生长。tsc-卵黄培养基的配制方法复杂，且产气荚膜梭菌产生的卵磷脂酶水解卵黄卵磷脂，使黑色
4、因此，有必要开发一种快速、高效、安全的产气荚膜梭菌的分离方法。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种产气荚膜梭菌分离方法，克服了现有方法速度慢、安全性差、分离效果不佳的技术缺陷。
2、本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术提出一种产气荚膜梭菌的分离方法，包括以下步骤：
4、s1、将待测病料进行增菌培养，得到初始菌液；
5、s2、将初始菌液进行稀释，将稀释菌液与tsn培养基混合，铺于培养皿中；
6、s3、待s2中的培养基完全凝固后，在培养基表面上覆盖一层tsn培养基，恒温培养，得到产气荚膜梭菌单菌落；
7、s4、挑取培养得到的产气荚膜梭菌单菌落，接种于液体培养基中进行培养，得到产气荚膜梭菌的菌液。
8、本专利技术还提出一种产气荚膜梭菌的鉴定方法，采用上述分离方法获得的产气荚膜梭菌菌液，进行以下任一项实验进行鉴定：
9、a.生化试验；
10、b.16s rrna pcr扩增与序列测定；
11、c.毒素分型。
12、本专利技术的技术方案至少获得以下技术效果：
13、本专利技术分离方法中分离培养采用tsn培养基，具有成本低、配制方法简单、污染概率极低、分离率高的技术优势。
14、本专利技术分离方法中菌液做梯度稀释后，与培养基混合凝固，再用培养基倾注覆盖，创造严格的厌氧环境。菌液与培养基混合凝固、再用培养基倾注覆盖，安全性更好、分离效果更好。
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1.一种产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，S1中，所述待测病料选自动物病变组织、动物肠内容物和疑似污染物，所述疑似污染物包括饲料、食品。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，S1中，所述增菌培养采用FTG液体培养基；
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述FTG液体培养基的组成为：胰蛋白胨、酵母膏粉、刃天青、L-胱氨酸、氯化钠、葡萄糖、硫乙醇酸钠、琼脂。
5.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在于，S2中，所述TSN培养基中含有：胰蛋白胨、酵母浸粉、亚硫酸钠、柠檬酸铁、多粘菌素B、硫酸新霉素、琼脂。
6.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在于，S2中，所述稀释采用无菌生理盐水或灭菌PBS生理盐水；
7.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在于，S2中，进行混合时，所述稀释菌液与所述TSN培养基的体积比为1：100；
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，S3中，所覆盖的T
9.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，S4中，所述培养基为RCM液体培养基；RCM液体培养基中含有：蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化钠、醋酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐和琼脂；
10.一种产气荚膜梭菌的鉴定方法，其特征在于，采用实施例1～9任一项所述的分离方法获得的产气荚膜梭菌菌液，进行以下任一项实验进行鉴定：
...【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，s1中，所述待测病料选自动物病变组织、动物肠内容物和疑似污染物，所述疑似污染物包括饲料、食品。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，s1中，所述增菌培养采用ftg液体培养基；
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述ftg液体培养基的组成为：胰蛋白胨、酵母膏粉、刃天青、l-胱氨酸、氯化钠、葡萄糖、硫乙醇酸钠、琼脂。
5.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在于，s2中，所述tsn培养基中含有：胰蛋白胨、酵母浸粉、亚硫酸钠、柠檬酸铁、多粘菌素b、硫酸新霉素、琼脂。
6.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在...
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