【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外重构肠道三维结构，具体涉及一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法及其应用。
技术介绍
1、人体肠道相关研究长久以来缺乏理想的体外模型，与其他器官相比，在体外再现肠道的结构和功能尤为困难，原因在于肠道环境的组成非常复杂，包含了多种类型的细胞和特殊的隐窝-绒毛结构。
2、目前体外重构肠道三维结构的方法多集中在通过材料科学和3d打印等技术先构建三维基质层，再将细胞平铺在三维基质层上以形成三维结构。然而，该方法最大的缺陷是：(1)无法反映肠道发育中细胞自组织形成三维结构的过程；(2)人工打印的三维结构不具备多样性，且与真实人体肠道的三维结构差异巨大，无法反映真实肠道情况。
3、通过细胞自组织形成肠道三维结构的方法，目前多集中在使用微流控肠道器官芯片，但其仍存在一定局限性：(1)微流控肠道器官芯片体系复杂，操作难度大，门槛高，并导致了后续结构观测困难；(2)利用该方法在体外获得的三维结构在表观上的相似度不高、三维结构的高度难以达到体内真实肠道隐窝-绒毛的高度、无法精确模拟真实肠道的细胞分布；(3)该方法复现三维结构需要对肠道原代细胞进行分离和培养，成本高且操作难度大；(4)该方法所用的微流控设备尺度小，即时观测需要额外的设备支持，且生成的细胞量无法满足后续的组学检测需求。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法及其应用，用以解决使用微流控肠道器官芯片构建肠道三维结构
2、为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术的第一个方面，公开了一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，对肠道细胞系依次使用液体-液体交换界面和气体-液体交换界面产生的压力差刺激，促进肠道细胞系自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构。
4、优选地，所述肠道细胞系为caco-2细胞系。
5、优选地，通过液液培养形成液体-液体交换界面，通过气液培养形成气体-液体交换界面。
6、进一步优选地，肠道细胞系在双层培养小室中进行培养。
7、进一步优选地，肠道细胞系的接种量为105个细胞/双层培养小室。
8、优选地，液液培养过程中，双层培养小室下室添加500μl完全培养基，上室添加200μl完全培养基。
9、优选地，液液培养过程中，在跨膜电阻大于150ω·cm2且zo-1蛋白紧密连接时，由液液培养换为气液培养。
10、优选地，气液培养过程中，上室绝对压力为0pa，上下室存在压力差。
11、本专利技术的第二个方面，公开了上述方法得到的肠道隐窝-绒毛三维结构。
12、本专利技术的第三个方面，公开了上述肠道隐窝-绒毛三维结构在人体肠道研究中的应用。
13、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
14、本专利技术提供的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，1、通过构建压力差使得肠道细胞系自组织形成了隐窝-绒毛结构，不需要额外的手段提供三维结构支持，真实再现肠道结构发育过程。2、重构的肠道隐窝-绒毛三维结构在高度、宽度、关键蛋白分布等形态特征上十分接近真实人体肠道。3、使用的实验材料简单，仅用到双层细胞培养小室和肠道细胞系，实验材料简单，门槛低，易推广。4、技术方案简洁易操作，且具备高鲁棒性。5、重构的肠道隐窝-绒毛三维结构易观测(明场相差显微镜即可观测到三维褶皱结构)，易进行冷冻切片并进行免疫荧光检测和三维结构观测。6、培养后形成的三维结构维度大，产生的细胞量能满足后续的多种组学检测。
15、进一步地，双层培养小室中上室和下室添加不同含量的完全培养基，能够保证形成细胞-细胞间紧密连接。
16、进一步地，以跨膜电阻大于150ω·cm2且zo-1蛋白显示明显的紧密连接时作为进入气液培养阶段的标志，能够保证形成的单层细胞具有均一性且在后续气液培养中受力均匀。
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1.一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，对肠道细胞系依次使用液体-液体交换界面和气体-液体交换界面产生的压力差刺激，促进肠道细胞系自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构。
2.根据权利要求1所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，所述肠道细胞系为Caco-2细胞系。
3.根据权利要求1或2所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，通过液液培养形成液体-液体交换界面，通过气液培养形成气体-液体交换界面。
4.根据权利要求3所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，肠道细胞系在双层培养小室中进行培养。
5.根据权利要求4所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，肠道细胞系的接种量为105个细胞/双层培养小室。
6.根据权利要求4所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，液液培养过程中，双层培养小室下室添加500μL完全培养基，上室添加200μL完全培养基。
7.根据权利要求4
8.根据权利要求4所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，气液培养过程中，上室绝对压力为0Pa，上下室存在压力差。
9.权利要求1～8任意一项所述的方法得到的肠道隐窝-绒毛三维结构。
10.权利要求9所述的肠道隐窝-绒毛三维结构在人体肠道研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，对肠道细胞系依次使用液体-液体交换界面和气体-液体交换界面产生的压力差刺激，促进肠道细胞系自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构。
2.根据权利要求1所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，所述肠道细胞系为caco-2细胞系。
3.根据权利要求1或2所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，通过液液培养形成液体-液体交换界面，通过气液培养形成气体-液体交换界面。
4.根据权利要求3所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，肠道细胞系在双层培养小室中进行培养。
5.根据权利要求4所述的一种体外自组织形成肠道隐窝-绒毛三维结构的方法，其特征在于，肠道细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：王澄瑶，叶凯，安欣悦，李妮娜，孙迪雅，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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