本发明专利技术涉及一种ＤＮＡ微阵列芯片，特别是涉及人类血液中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）、丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）、人类免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）集成高通量检测ＤＮＡ微阵列芯片。本发明专利技术采用固相载体基片，针对ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ－１病毒基因设计的寡核苷酸探针，制备成ＤＮＡ微阵列芯片，再配以ＰＣＲ引物以及其它组分，可以高灵敏度、高特异性的一次性同时检测多个样本中三种病毒，主要应用于血液、血制品病毒核酸筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及人类血液中乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒l型(HIV-1)集成高通量检测DNA微阵列芯片。本专利技术采用固相载体基片，针对HBV、 HCV、 HIV-1病毒基因设计的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以高灵敏度、高特异性的一次性同时检测多个样本中三种病毒，主要应用于血液、血制品病毒核酸筛査。
技术介绍
确保血液及血液制品的安全，最大限度地降低经血传播病毒的危险， 一直是世界各国关注的问题。随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性己大大降低，但由于病毒感染者"窗口期"献血、病毒变异、低病毒载量感染等因素,使得临床输血安全依然存在一定风险。与原有的免疫学检测技术相比，核酸检测技术(NAT)可直接检测病毒核酸,能大大縮短病毒"窗口期"，极大提高血液的安全性，已在国内外广泛应用于血液常规筛查。自1971年开始HBsAg作为常规筛査项目引入到血液筛查中，使得输血后感染乙肝的发生率大大降低，酶免疫检测(ELISA)技术已经广泛应用于血液筛査，检测HBs-Ag的灵敏度已由最初30-50ng/ml到现在的0.5—1.0ng/ml，有的试剂甚至达到0.1ng/ml以下，但每年仍有少量新发输血后肝炎病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1/6.3万，这些危险主来自HBV"窗口期"、病毒变异、低病毒载量感染等。ELISA法筛查并不能从根本上排除病毒存在的危险，由于HBV感染后病毒颗粒先于HBsAg释放到血液中，在约50d的"窗口期"里，感染者HBsAg检测阴性，但病毒已经存在于血液中。HBV、 HIV-1的情况与HBV具有相似的情况。核酸检测技术的应用可以大幅度縮短检测的窗口期，大大提高血液安全性。欧美国家的经验表明，核酸检测应用于血液筛査能够有效縮短HCV抗体检测窗口期72%，縮短HIV-1抗体检测窗口期50%。日本也报道使用HBV核酸检测筛査可以进一步减少HBsAg的漏检。1993年，Chiron公司的TMA技术和Roch公司的AmpliScreen技术在美国FDA获批用于血液筛査；1999年欧洲规定所有的血浆制品生产均应进行HCV PCR检测；2001年日本和法国将NAT技术应用于血筛。我国卫生行政部门也规定，2003年1月1曰以后，所有血浆制品的原料在投产前，必须进行NAT检测。输血和血制品HBV、 HCV、 HIV-1核酸筛查检测也正在广泛推广。对于血液筛査核酸检测技术和试剂，目前我国卫生行政部门在国内组织尝试荧光PCR检测方法，基本筛査方式是采用Pooling法，即12或者24个样本混合，作为一个样本检测，有阳性结果时，再分别逐个检测混合样本中各个单样本，从而溯源到阳性样本。这个方法要求所用的核酸提取和荧光PCR检测试剂具有高度灵敏度。但是，目前国内外最先进的核酸提取和荧光PCR试剂都很难达到要求；如果不采用Pooling法，直接检测每一份样本，检测通量之低和试剂成本之高又是无法接受的！如何解决这个问题？DNA微阵列技术是本世纪90年代以来发展起来的新型筛査检测技术，该技术具有高通量、集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析。该技术应用于血液筛查将很好地解决灵敏度和通量之间的矛盾，可以在非Pooling情况下， 一次检测数十个样本，是血液筛査的良好检测技术。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，制造具有高通量、高准确性的DNA微阵列芯片，可以一次同时对数十例血液或血制品样本中HBV、 HCV、 HIV-1病毒进行检测，适合血液和血制品病毒筛査。因此，本专利技术的目的是制备一种血液HBV、 HCV、 HIV-1集成检测DNA微阵列芯片，以满足大规模血液和血制品中病毒筛査检测的需要。为此，本专利技术采用以下技术方案采用固相载体基片，针对HBV、 HCV、 HIV-1核酸设计特异寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，再配以特殊PCR系统，使得每张芯片可以一次性同时检测数十个样本中三种病毒。根据本专利技术一个优选的实施方案，针对HBV、 HCV、 HIV-1核酸保守序列，设计一套特异性寡核苷酸探针(见表l)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制40个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片， 一张芯片可以检测38个样本和2个参照品。根据本专利技术另一个优选的实施方案，在上述的DNA微阵列芯片的基础上再配以其它必要的组份，如PCR引物(见表2)，即组成完整的产品。RT-PCR反应采用单管多重扩增，实际检测时，取38份人血液或者血制品提取的基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称RT-PCR方法，扩增出可能存在的病毒基因组CY3标记靶标片段。取DNA微阵列芯片一张，在38个杂交区分别加入38种PCR产物2ul和杂交液8ul，同时在阳性和阴性参照区加入参照产物溶液，将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度优选为45'C，杂交时间优选30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本检测结果。根据本专利技术另一个优选的实施方案，DNA微阵列芯片的片基载体可以是玻片、尼龙膜或其它可以附着探针的载体。表l寡核苷酸探针序列以及所检测的病毒<table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table>附图说明图1 血液HBV、 HCV、 HIV-1集成检测DNA微阵列芯片1芯片整体外观(示意图)2杂交区以及探针微阵列(示意图) 图2 HBV阳性扫描图(示意图) 图3 HCV阳性扫描图(示意图) 图4 HIV-1阳性扫描图(示意图) 图5 HCV、 HIV-1混合阳性扫描图(示意图) 图6 HBV、 HCV、 HIV-1阴性扫描图(示意图) 图7 HBV、 HCV、 HIV-1阳性对照区扫描图(示意图) 图8 HBV、 HCV、 HIV-1阴性对照区扫描图(示意图)具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本专利技术。实施例1: HBV、 HCV、 HIV-1病毒基因特异引物和探针的设计HBV在5' UTR区设计特异探针一条和特异性引物一对；HCV针对5' NCR区设计涵盖4个基因型，6个亚型的探针共6条。六条探针按照等比浓 度混合后点制芯片；HCV在5'NCR区设计两对PCR引物，外引物序列正义 5'-TGTGAGGAACTTCTGTCTTC-3'，反义5'-CATGATGCACGGTCTACGA-3';内引物序列正义 5'-GCCATGGCGTTAGTACGA-3'，反义5'-TCGCAAGCACCCTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＤＮＡ微阵列芯片，采用ＤＮＡ微阵列芯片技术，对人类血液中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）、丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）、人类免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）进行集成高通量检测筛查，其特征在于将ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ－１特异性寡核苷酸探针，点制在载体上，并分成４０个区，制成ＤＮＡ微阵列芯片，再配以ＰＣＲ引物以及其它组分，组成完整的试剂盒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡守旺，张帆，李明，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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