本发明专利技术公开了一种丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子药物及制备方法和用途，ＤＮＡ适配子序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－２９所示的核苷酸序列，其步骤是：首先是构建随机单链ＤＮＡ文库的；其次是合成双链ＤＮＡ文库；第三是ＳＥＬＥＸ筛选；第四是ＰＣＲ扩增；第五是克隆和测序；第六是通过体外细胞水平实验证实ＤＮＡ适配子的效果。小分子核苷酸适配子在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途，该ＤＮＡ适配子可直接作为丙型肝炎病毒拮抗剂和诊断试剂使用，可用于预防、检测和治疗丙型肝炎，克服临床只以α干扰素或将α干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，α干扰素和病毒唑联合治疗副作用大。并且目前丙型肝炎无疫苗预防。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物感染免疫和检验领域,具体涉及一种能特异性抑制丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染人细胞的小分子核苷酸序列(或称DNA适配子)，具有SEQIDN0.1-29所示的小分子核苷酸序列(或称单链DNA适配子)。同时还涉及制备能与丙型肝炎病毒特异结合，特异性拮抗丙型肝炎病毒感染的高亲合力的小分子DNA适配子的方法，小分子的DNA适配子在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途，该DNA适配子核苷酸同时还作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的临床新型诊断试剂。
技术介绍
1989年首次鉴定出丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)，至今已有大约nO万的世界人口感染有HCV，我国感染者占全国总人口3.2%，其中80%的感染者发展成为慢性。HCV是HIV感染的5倍，并且艾滋病合并HCV感染发病率高达6(T/。 80%，并且我国HCV感染率将有可能逐渐升高。医源性的输入HCV所污染的血液是丙型肝炎传播的主要方式，丙型肝炎发病缓慢及隐匿易形成慢性肝炎和肝硬化，后期常发展成为肝细胞性肝癌。临床上主要将a干扰素或将a干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，这种治疗方法往往也只是对早期病人的效果比较明显。目前无疫苗预防。因此在血液样品中正确及灵敏的检测HCV是防范HCV的关键。HCV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒家族，基因组(大约9.6kb)含有一个开放阅读框编码3010氨基酸的蛋白前体。通过宿主和病毒蛋白水解酶的共同作用形成9个不同的结构和非结构蛋白，宿主信号肽的剪切后，HCV包膜糖蛋白E1(gp35)和E2(gp70)形成。虽然在分子水平上病毒感染和复制的确切机制还未明了，但是包膜糖蛋白E2在HCV病毒感染的初始和通过与人CD81为主的细胞受体分子的识别和结合，在宿主细胞的粘附和侵袭中都起到了十分关键性的作用已经被公认。HCV-E2 DNA适配子作为早期诊断试剂及拮抗HCV的治疗药物，为献血者HCV的筛选、早期感染的确诊、抗HCV感染和丙型肝炎的治疗提供了一条新的途径。此外，适配子还将在某些方面取代抗体，成为一种新的受体抑制剂和检测试剂，其应用前景十分诱人。SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，应用范围十分广泛。已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和性和特异性，具有良好的应用前景。适配子与传统意义上抗体相比，具有分子量小，能更快地渗入细胞，更迅速在血液中清除，能够稳定合成，便于修饰等特点。是极有潜力的作为预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。本研究中，我们采用SELEX技术对CT26-HCV-E2细胞进行筛选，并用CT26细胞进行反筛，以获得能特异性拮抗丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的生物活性小分子核苷酸适配子(Aptamer)分子。为丙型肝炎病毒感染机制的研究，丙型肝炎治疗性新型药物和新型诊断试剂的开发而奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子，该DNA适配子为预防和治疗丙型肝炎提供了新型的拮抗剂，可以克服临床只以a干扰素或将a干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，且只是对早期病人的效果比较明显，并且联合治疗副作用大。丙型肝炎无疫苗预防。本专利技术的另一个目的是提供了一种制备能特异性拮抗丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子的方法，该方法通过随机单链DNA文库和引物的构建、合成双链DNA文库、PCR扩增、SELEX筛选、体外细胞水平抑制HCV-E2蛋白与受体的结合实验，HCV活病毒结合和抑制实验，得到能抑制HCV-E2蛋白结合DC-SIGN、 CD81等受体以及抑制活病毒侵袭肝细胞的DNA适配子。其优点在于DNA适配 子预防HCV的入侵和进一步扩散的同时无抗原性，容易被排泄。本专利技术的再一个目的是在于提供了一种小分子DNA适配子在制备治疗或预防 丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途。其能特异抑制丙型肝炎病毒活病毒感 染人肝细胞；竞争性抑制丙型肝炎病毒与受体CD81的结合；抑制HCV包膜抗原 E2与人肝细胞的结合。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种能特异性拮抗丙型肝炎病毒的DNA适配子，其具有SEQIDNO.l, SEQIDN0.2, SEQIDN0.3， SEQIDN0.4， SEQIDN0.5， SEQIDN0.6, SEQIDN0.7， SEQIDN0.8, SEQIDN0.9, SEQIDNO.ll, SEQIDNO,12, SEQIDN0.13, SEQIDN0.14, SEQIDN0.15, SEQIDN0.16, SEQIDN0.17, SEQ薩0.18, SEQIDNO. 19， SEQIDNO.20, SEQIDN0.21， SEQIDNO,22, SEQIDN0.23, SEQIDN0.24, SEQIDN0.25, SEQIDN0.26， SEQIDN0.27, SEQIDN0.28， SEQIDN0.29所示的核苷酸序列。一种能特异性拮抗丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子的制备方法，按下列 歩骤顺序进行1、 构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链 DNA(ssDNA)文库 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-Nm-GGGTCAATGCGTCATA-S' ，其中N代表碱基A, G, T, C中的任意一个，该文库的 容量约为1014 1015;构建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3'，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性 内切酶五coRI的酶切位点；构建下游引物5'-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，， 该引物中含有DNA限制性内切酶5awHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物 可由引物合成公司(赛百胜公司)合成。2、 双链DNA (dsDNA)及单链DNA (ssDNA)文库的PCR扩增，保存每轮筛 选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库(共14轮)，保存，并以dsDNA文库为模 板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。为了稳定条件，不改变反应程序94'C 4min， 94°C 30s， 56°C 45s， 72°C lmin30s， 18~25个循环，72°C 7min。调节循环次数以获得最佳扩增效果(18~25个循环)。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检 测，试剂盒回收纯化。3、 PCR扩增产物的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的核酸，其特征在于：小分子核苷酸适配子； 所述的小分子核苷酸适配子序列为ＳＥＱＩＤＮＯ．１、ＳＥＱＩＤＮＯ．２、ＳＥＱＩＤＮＯ．３、ＳＥＱＩＤＮＯ．４、ＳＥＱＩＤＮＯ．５、ＳＥＱＩＤＮＯ．６、ＳＥＱＩＤＮＯ．７、ＳＥＱＩＤＮＯ ．８、ＳＥＱＩＤＮＯ．９、ＳＥＱＩＤＮＯ．１０、ＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２、ＳＥＱＩＤＮＯ．１３、ＳＥＱＩＤＮＯ．１４、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５、ＳＥＱＩＤＮＯ．１６、ＳＥＱＩＤＮＯ．１７、ＳＥＱＩＤＮＯ．１８、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９、ＳＥＱＩＤＮＯ．２０、ＳＥＱＩＤＮＯ．２１、ＳＥＱＩＤＮＯ．２２、ＳＥＱＩＤＮＯ．２３、ＳＥＱＩＤＮＯ．２４、ＳＥＱＩＤＮＯ．２５、ＳＥＱＩＤＮＯ．２６、ＳＥＱＩＤＮＯ．２７、ＳＥＱＩＤＮＯ．２８、ＳＥＱＩＤＮＯ．２９所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈芳，章晓联，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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