【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法。
技术介绍
1、外泌体(exosome)属于细胞外囊泡(extracellular vesicle，ev)的一种，是细胞在分泌作用下自然释放的具有脂质双分子层的球状或椭圆状囊泡。具有来源广泛、无伦理问题、作用效率高、体积小，易穿透和具有特异性等特点，使其在无细胞治疗中具有吸引力。因此，近年来受到了科学界的关注，其内容物在生理和病理过程中发挥着重要作用。
2、近年来，外泌体相关研究越来越多，但大多停留在临床前实验，其中很大一部分原因是因为外泌体的产量是其大规模生产的限制因素。提高外泌体产量的方法有很多，主要可以分为以下几个方面：物理化学刺激、从大流体样本中获取和通过三维培养装置等，然而这些方法都存在一些缺点，这提示我们需从根本上解决细胞外泌体产量少的问题，具体如下：
3、(1)物理化学刺激：酒精剂量依赖性地增加了小胶质源性外泌体中评估外泌体活性的标志物mmp2的水平。物理刺激，低强度脉冲超声(lipus)可以增强bmsc-exo的软骨再生效果，可能是通过抑制nf-κb信号通路抑制炎症反应。然而，超声的再现性和有效性较差，因此有必要探讨不同供体细胞在超声下的适宜暴露条件，并评估超声后样品性质的影响。其他物理刺激方法还有改变ph值或低氧条件，但它们对外泌体生理特性的长期影响需要评估。
4、(2)从大流体样本中获取：利用血液来源的外泌体。在输血过程中使用血细胞来源的ev也有大量的安全性数据，且在大多数情况下没有明显的
5、(3)三维培养装置：3d培养装置会导致一些囊泡转运蛋白(alix、tsg101、adam10、cd63、syntenin-1等)的mrna表达也发生了改变。这些变化共同影响外泌体的产生和分泌。并且基于3d培养的反应器的一个缺点是，由于细胞代谢增强，需要频繁更换培养基，这也增加了操作过程中污染风险。
6、(4)基于瞬时转染的工程化细胞所携带的基因和活性物质会受到细胞分裂和传代的影响，导致表达量逐渐降低，无法长期稳定产生相应的功能物质。
7、慢病毒具有携带基因片段容量大、转染效率高、宿主范围广并且能长期稳定表达等优点，其中的毒力基因己经被剔除，并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒，因此没有毒性作用。慢病毒载体作为基因传递工具将基因转入细胞，并不影响宿主细胞本身基因组的正常功能，现已经成为转移目的基因的理想载体并用于临床治疗。
8、基于以上，本专利技术首次利用慢病毒载体过表达载体，将steap3、sdc4和nadb三个基因整合到raw264.7细胞、nih-3t3细胞和hacat细胞基因组上，旨在通过基因工程的方式稳健地提高外泌体的分泌量，以期为生物医学、医疗美容、化妆品等领域提供更广泛的外泌体材料和途径。
技术实现思路
1、要解决的技术问题：针对上述的技术问题，本专利技术的目的是提供一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，具体步骤为：s1.选择steap3、sdc4以及nadb基因在细胞内过表达；s2.设计和制备慢病毒过表达质粒；s3.制备和浓缩病毒颗粒；s4.病毒液侵染raw264.7细胞、nih-3t3细胞以及hacat细胞并筛选出阳性细胞；s5.稳定转染后阳性细胞外泌体分泌量的测定。本专利技术首次使用慢病毒转染技术在raw264.7细胞、nih-3t3细胞和hacat细胞中表达steap3、sdc4以及nadb基因，具有分泌更多外泌体的功能，为烧伤、创面、创伤、手术、美容等皮肤创面修复和研究提供更多的外泌体材料和途径。
2、技术方案：一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，包括以下步骤：
3、s1.选择steap3、sdc4以及nadb基因在细胞内过表达：通过ncbi确定steap3、sdc4和nadb基因的cds序列，通过2a连接肽进行连接；
4、s2.设计和制备慢病毒过表达质粒：以lo2肝细胞的cdna和商业化质粒为模版，用普通pcr技术和搭桥pcr技术扩增出带有2a连接肽序列的steap3、sdc4和nadb三个目的基因片段，并通过无缝克隆技术将目的基因片段与慢病毒载体相连接，获得含有三个目的基因的多顺反子慢病毒表达载体；
5、s3.制备和浓缩病毒颗粒：采用四质粒包装系统，大提三个辅助质粒和含有目的基因的转移质粒，以293t细胞为工程细胞用于包装含有过表达steap3、sdc4和nadb基因功能的病毒颗粒，并通过超高速离心机浓缩病毒颗粒；
6、s4.病毒液侵染raw264.7细胞、nih-3t3细胞以及hacat细胞并筛选出阳性细胞：针对三种细胞设置不同的嘌呤霉素浓度梯度，选择48h能杀死90％以上细胞的最低嘌呤霉素浓度；含有感染目的基因的病毒颗粒侵染raw264.7细胞、nih-3t3细胞以及hacat细胞后，用嘌呤霉素浓度进行筛选三轮，倒置荧光显微镜拍摄每轮荧光表达情况，并分别提取第5代细胞的rna，用试剂盒进行逆转录成cdna后，以cdna为模版，通过普通pcr技术对三个目的基因进行鉴定，筛选出阳性细胞；
7、s5.稳定转染后阳性细胞外泌体分泌量的测定：利用瞬时转染技术在外泌体特异性蛋白cd63上标记nluc荧光素酶，通过荧光素酶检测试剂检测荧光值，nta测定外泌体的数量和粒径，测定转染三个目的基因的细胞与转染空载质粒细胞的外泌体分泌量。
8、进一步的，所述步骤s1中steap3、sdc4和nadb基因的cds序列长度分别为1464bp、596bp和993bp。
9、进一步的，所述步骤s1中2a连接肽为p2a、t2a、e2a，具体序列如下：
10、p2a：5'-gccacaaacttctctctgctaaagcaagcaggtgatgttgaagaaaaccc cgggcct-3’；
11、t2a：5'-gagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaaaatcccgg ccca-3’；
12、e2a：5'-cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacc caggtccc-3’。
13、进一步的，所述步骤s1中steap3序列如seq id no.1所示，所述sdc4序列如seq idno.2，所述nadb序列如seq id no.3所示，具体序列如下：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于：所述步骤S1中STEAP3、SDC4和NadB基因的CDS序列长度分别为1464bp、596bp和993bp。
3.根据权利要求1所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤S1中2A连接肽为P2A、T2A、E2A，具体序列如下：
4.根据权利要求1所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤S1中STEAP3序列如SEQ ID NO.1所示，所述SDC4序列如SEQIDNO.2，所述NadB序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列如下：
5.根据权利要求1所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤S2中搭桥PCR技术具体为：设计引物时，在部分引物的上游或者下游添加部分序列；在扩增载体片段时，在其上游引物前端引入部分E2A序列，在
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法在皮肤创面修复和无细胞疗法药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于：所述步骤s1中steap3、sdc4和nadb基因的cds序列长度分别为1464bp、596bp和993bp。
3.根据权利要求1所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤s1中2a连接肽为p2a、t2a、e2a，具体序列如下：
4.根据权利要求1所述的一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤s1中steap3序列如seq id no.1所示，所述sdc4序列如seqidno.2，所述nadb序列如seq id ...
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