【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、核酸靶标捕获方法可以允许富集特定基因、外显子和其他感兴趣的基因组区域，例如以用于靶向测序。然而，基于靶标捕获的测序方法可涉及繁琐冗长的方案和昂贵的过程，以及较小捕获小组(例如，少于500个探针)的低在靶率。此外，用于核酸靶标捕获的当前方法由于低回收率而不适合用于低输入和受损的dna。
2、亚硫酸盐转换可为研究核酸分子的甲基化模式的有用技术。然而，亚硫酸盐转换可能会通过例如造成截断来损伤核酸。如果用亚硫酸氢盐处理下一代测序(next-generation sequencing,ngs)dna文库，则大量的核酸可能会受损，并且无法在随后的扩增步骤中恢复，并由此提供低回收率。此外，由于亚硫酸盐转换可能导致单链或片段化的dna并降低序列复杂性，因此经转换的dna对于基于传统衔接子连接的文库构建来说可能是困难输入。在给定低回收率(例如，对于经亚硫酸盐处理的cfdna为5％或更低)的情况下，通常具有小初始输入的经亚硫酸盐处理的无细胞dna(cell-free dna,cfdna)或循环肿瘤细胞dna(circulating tumor cell dna,ctdna)可能带来更大的挑战。还可以执行甲基化敏感的酶促处理来转换甲基化的胞嘧啶。然而，基于酶的方法在长期和多步骤的过程期间仍然会遭受甲基化状态的丧失，从而导致低回收率。
3、无细胞dna的甲基化分析对于早期癌症检测来说具有巨大潜力。在早期癌症患者的血浆中，肿瘤含量估计小于0.1％，往往低至0.01％或更低，并且因此需要高度灵敏的测定。目前存在两种用
4、因此，特别是对于低输入样本(例如cfdna)，需要一种更高效、易于使用、快速、灵活和实用的靶核酸捕获方法以及用于分析经亚硫酸氢盐处理的核酸的改进方法。本文所公开的方法可用于极低dna输入样本的扩增前和亚硫酸氢盐转换前基于杂交的捕获。需要对低输入样本中的核酸分子进行条形码编码的改进方法。
技术实现思路
1、本文提供了一种方法，所述方法包括：获得模板核酸分子(本文中也称为靶分子)，所述模板核酸分子包含在所述模板核酸分子的3'端的衔接子；使核酸条形码分子(本文中也称为延伸模板)与所述衔接子退火，其中所述核酸条形码分子包含条形码序列；使用所述核酸条形码分子作为模板来延伸所述衔接子，从而生成包含所述条形码序列的互补序列的延伸产物；使第一桥探针的第一靶特异性区域与所述模板核酸分子的第一靶序列杂交，其中所述第一桥探针的第一锚探针着陆序列与锚探针的第一桥结合序列结合；以及使第二桥探针的第二靶特异性区域与所述模板核酸分子的第二靶序列杂交，其中所述第二桥探针的第二锚探针着陆序列与所述锚探针的第二桥结合序列结合，从而生成复合物。
2、在一些情况中，第一桥探针的第一靶特异性区域与延伸产物的模板核酸分子的第一靶序列杂交，并且第二桥探针的第二靶特异性区域与延伸产物的模板核酸分子的第二靶序列杂交。
3、在一些情况中，所述方法进一步包括将衔接子附接至模板核酸分子的3'端，从而生成包含所述衔接子的模板核酸分子。所述衔接子可以包含引物结合序列，并且所述核酸条形码分子可以包含引物，所述引物被设计或配置为与所述衔接子的引物结合序列杂交。
4、在一些情况中，所述方法进一步包括将模板核酸分子和核酸条形码分子与一种或多种引物延伸试剂组合。
5、在一些情况中，所述延伸步骤在所述杂交步骤之前执行。所述延伸产物可以与包含第一桥探针、第二桥探针和锚探针的杂交混合物组合。
6、在一些情况中，所述延伸步骤在杂交步骤之后执行。可以在延伸衔接子的步骤之前将模板核酸分子和核酸条形码分子在杂交混合物中组合，其中该杂交混合物包含第一桥探针、第二桥探针和锚探针。
7、在一些情况中，所述方法进一步包括将衔接子附接至模板核酸分子的5'端。在一些情况中，该方法进一步包括将第一y衔接子附接至模板核酸分子的3'端；以及将第二y衔接子附接至模板核酸分子的5'端，其中所述第一y衔接子和所述第二y衔接子不包含唯一分子标识符序列。
8、在一些情况中，所述条形码序列包括样本索引序列。在一些情况中，所述核酸条形码分子包含唯一分子标识符(unique molecular identifier,umi)序列。在一些情况中，核酸条形码分子包含3'终止子。在一些情况中，3'端处的衔接子包括y衔接子。在一些情况中，y衔接子包含样本索引序列，所述样本索引序列包含在所述y衔接子的顶部分支和/或底部分支中。在一些情况中，3'端处的接头不包含条形码序列。
9、在一些情况中，所述方法进一步包括将所述复合物偶联至固相载体。在一些情况中，所述方法进一步包括扩增来自所述复合物的延伸产物以生成扩增产物。在一些情况中，所述方法进一步包括对扩增产物进行测序。在一些情况中，所述方法进一步包括使用来自复合物的延伸产物进行甲基化分析。
10、以引用方式并入
11、本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以相同的程度以引用方式并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指明为以引用方式并入一样。
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1.一种方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一桥探针的所述第一靶特异性区域与所述延伸产物的所述模板核酸分子的所述第一靶序列杂交，并且
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将所述衔接子附接至所述模板核酸分子的3'端，从而生成包含所述衔接子的所述模板核酸分子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述衔接子包含引物结合序列，并且所述核酸条形码分子包含被设计为与所述衔接子的所述引物结合序列杂交的引物。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括将所述模板核酸分子和所述核酸条形码分子与一种或多种引物延伸试剂组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸步骤在所述杂交步骤之前执行。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括将所述延伸产物与包含所述第一桥探针、所述第二桥探针和所述锚探针的杂交混合物组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸步骤在所述杂交步骤之后执行。
9.根据权利要求8所述的方法，所述方法包括在所述延伸所述衔接子的步骤之前将所
10.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将衔接子附接至模板核酸分子的5'端。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条形码序列的所述条形码序列包含样本索引序列。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条形码分子的所述条形码序列包含唯一分子标识符序列。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条形码分子包含3'终止子。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板核酸分子的3'端处的所述衔接子是Y衔接子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述Y衔接子包含样本索引序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述样本索引包含在所述Y衔接子的底部分支中。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述3'端处的所述衔接子不包含条形码序列。
18.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板核酸分子是包含第一链和第二链的双链分子，并且衔接子附接在所述第一链和所述第二链两者的3'端处。
20.根据权利要求19所述的方法，其中衔接子附接在所述双链分子的所述第一链和所述第二链的5'端处。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板核酸分子是单链分子，并且衔接子附接在所述模板核酸分子的3'端和5'端两者处。
22.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将所述复合物偶联至固体载体。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法进一步包括扩增来自所述复合物的所述延伸产物以产生扩增产物。
24.根据权利要求23所述的方法，所述方法进一步包括对所述扩增产物进行测序。
25.根据权利要求22所述的方法，所述方法进一步包括使用来自所述复合物的所述延伸产物进行甲基化分析。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一桥探针的所述第一靶特异性区域与所述延伸产物的所述模板核酸分子的所述第一靶序列杂交，并且
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将所述衔接子附接至所述模板核酸分子的3'端，从而生成包含所述衔接子的所述模板核酸分子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述衔接子包含引物结合序列，并且所述核酸条形码分子包含被设计为与所述衔接子的所述引物结合序列杂交的引物。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括将所述模板核酸分子和所述核酸条形码分子与一种或多种引物延伸试剂组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸步骤在所述杂交步骤之前执行。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括将所述延伸产物与包含所述第一桥探针、所述第二桥探针和所述锚探针的杂交混合物组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸步骤在所述杂交步骤之后执行。
9.根据权利要求8所述的方法，所述方法包括在所述延伸所述衔接子的步骤之前将所述模板核酸分子和所述核酸条形码分子在杂交混合物中组合，其中所述杂交混合物包含所述第一桥探针、所述第二桥探针和所述锚探针。
10.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将衔接子附接至模板核酸分子的5'端。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条形码序列的所述条形码序列包含样本索引序列。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条...
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