【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，具体涉及一种酸稳定性和可溶表达量提高的羧肽酶a突变体的设计和制备方法。
技术介绍
1、赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)是由曲霉属(aspergillus)和青霉属(penicillium)等丝状真菌产生的一类次级代谢产物，其结构为苯丙酸异香豆素。ota常在各种植物和动物源性食品中出现，对人体造成肾毒性、肝毒性等毒性作用，目前已被国际癌症研究机构(iarc)列为iib类致癌物。我国作为农业生产大国和消费大国，小麦、玉米、花生、葡萄及其制品、咖啡及其制品等农产品/食品易被ota污染，通过食物链各环节可被人体直接或间接摄入，存在严重的食品安全风险。此外，ota性质稳定，不易降解，目前酶法脱毒是其污染防控最关键的技术。
2、源于牛胰腺的羧肽酶a(carboxypeptidase a，cpa，ec 3.4.17.1)是最早发现的ota降解酶，其具有清晰的三级晶体结构和明确的催化机制，可将ota水解为无毒的otα，其对于ota的降解能力受到广泛认可，在葡萄酒、咖啡等农产品/食品以及饲料的脱毒方面具有很好的应用前景。cpa是一种中性酶，而易受ota侵染的食品等基质大多呈酸性，这限制了其脱除食品等中ota的应用。因此，对cpa进行酸稳定性改造能够提高其在酸性条件下的催化效率，提高酶的使用率。目前，常用的酸稳定性改造策略是在酶的氨基酸序列、三级结构特征以及酶的催化机制的基础上，借助计算机预测设计点突变。该方法靶向性强，能够有效减少筛选范围，提高筛选效率，进而提高改造的准确率。
3、此外
技术实现思路
1、制约羧肽酶a工业化应用的主要瓶颈是其酸稳定性差以及含量有限。因此，开发具有良好的酸稳定性且表达量高的羧肽酶a具有重要意义。本专利技术提供一种酸稳定性和可溶表达量均提高的羧肽酶a突变体，与野生型相比，本专利技术的改造酶具有更好的酸稳定性和更高的可溶表达量，且仍具有赭曲霉毒素a降解功能，有较大的应用潜力。
2、为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一株酸稳定和可溶表达量均提高的，且具有ota降解活性的羧肽酶a突变体。
3、本专利技术的第一个目的是提供一种酸稳定性和可溶表达量均提高的羧肽酶a突变体。
4、本专利技术的第二个目的是提供所述羧肽酶a突变体的编码基因、携带羧肽酶a突变体基因的载体以及羧肽酶a突变体的重组表达菌株。所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
5、本专利技术的第三个目的是提供一种设计上述突变体的方法，包括以下步骤：
6、步骤1：借助pymol软件将牛胰腺羧肽酶a的氨基酸序列seq id no.1在催化残基范围内非保守的氨基酸，且不参与催化反应的氨基酸做为候选的突变位点。
7、步骤2：将候选突变位点突变为d、e、r、h、k、y这6种可电离的氨基酸。通过同源建模构建突变体的三级结构，借助pka值预测软件预测各个突变体催化残基的pka值，选择突变前后pka值显著降低的突变体确定为潜在的酸稳定性提高的突变体。
8、本专利技术的第四个目的是提供一种提高大肠杆菌异源蛋白可溶表达量的sumo标签促溶表达技术。
9、本专利技术的第五个目的是提供上述突变体在赭曲霉毒素a脱除领域中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种具有降解赭曲霉毒素a功能的羧肽酶a突变体l203h，该突变体72h内在ph 6.0下对1μg/ml的ota降解率为98.76％。与野生型羧肽酶a相比，该突变体的最适ph从8.0降到6.0，向酸性方向迁移两个单位。此外，突变体l203h的可溶表达量达到16.56mg/ml，而未融合sumo标签的野生型羧肽酶a的可溶表达量为5.25mg/ml。因此，突变体l203h有效地提高了羧肽酶a的酸稳定性和可溶表达量，在食品/农产品以及饲料脱毒领域具有广阔的应用前景。
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1.一种酸稳定性和可溶表达量提高的牛胰腺羧肽酶A突变体，其特征在于，以氨基酸序列SEQ IDNo.1所示的牛胰腺羧肽酶A为亲本酶，至少发生以下三种序列修饰中的一种，将第203位的亮氨酸突变为组氨酸，在氨基酸序列SEQ ID No.1的N端添加小分子泛素相关修饰物SUMO促溶标签的氨基酸序列SEQ ID No.2，在氨基酸序列SEQ ID No.1的C端添加10个长度的His纯化标签，最终完整的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的牛胰腺羧肽酶A突变体的基因。
3.包含权利要求2所述的牛胰腺羧肽酶A突变体编码基因的载体。
4.如权利要求3所述的编码基因的载体，其特征在于，所述载体为pET-28a(+)；突变体编码基因经过大肠杆菌密码子优化，所述密码子优化的羧肽酶A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.包含权利要求2所述的突变体基因及权利要求3所述载体的工程菌。
6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌E.coli DH5α或BL21(DE3)。
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