【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，尤其涉及一种基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统及方法。
技术介绍
1、在过去的几十年里，人们一直在推动采用敏感的方法进行癌症的早期检测。这种需求的出现是因为癌症是最致命的疾病。如果能够早期监测，癌症死亡率可以显著降低。然而，早期癌症的诊断需要检测和定量超低浓度的生物标志物，这些标志物表现在癌变的早期阶段。在临床实践中，可通过检测血清或血浆中的自身抗体水平来判断疾病进展。与其他癌症生物标志物相比，自身抗体具有早期滴度高、循环稳定、易于获取和检测等优点。研究表明，pdl1自身抗体可广泛分布于多种肿瘤中，且在不同类型的肿瘤中，pdl1自身抗体与临床参数之间存在显著相关性。此外，我们前期研究采用酶联免疫吸附测定(elisa)检测了肺癌患者和健康样本中pdl1自身抗体的表达水平，结果表明pdl1自身抗体在肺癌的诊断中具有良好的潜在价值。
2、随着多学科的发展，自身抗体检测方法得到不断改进，检测方法多样化。从1948年haragrave等发现了狼疮细胞开始，越来越多的与自身免疫病相关的自身抗体被研究发现，免疫学检测技术也逐步发展，日渐成熟。之后几十年，自身抗体的检测方法得到飞速发展，许多方法先后被改进并被用于临床诊断。其检测方法可分为定性和定量两类。定性的免疫检测方法：间接免疫荧光技术，免疫扩散、免疫印迹、免疫沉淀法、被动凝集法、对流免疫电泳。半自动化或自动化定量检测的免疫检测方法：放射免疫分析、酶联免疫吸附试验。目前，elisa是一种成熟的基于靶抗原与抗体特异性结合的免疫检测方法，已广泛应用于临床诊
3、此外自身抗体检测方法受到很多主观因素的影响，且标准化程度不理想，在临床应用存在一定的局限性。如何实现自身抗体高效、准确、智能化、高通量的定量检测是未来研究自身抗体检测方法的重点。因此，尝试进一步改进类似于elisa方法的检测途径，如使用磁珠(mb)或实施信号放大器等成为研究的重点。mb的应用为增强免疫检测技术的发展提供了一种总体策略，市售的mb种类繁多，具有不同的大小和表面化学功能，用抗原或抗体修饰mb，可以快速、温和、简单地从其他样品成分中分离和浓缩目标分子。与二维表面相比，mb与样品的主动混合促进了更快的免疫反应，具有更高的信号和更低的检测限(lod)。此外，免疫修饰mb的生产相对容易规模化，磁性elisa具有自动化的潜力。在传统的自身抗体检测中，辣根过氧化物酶(hrp)偶联检测抗体作为探针，催化过氧化氢还原和显色底物氧化产生比色信号，但检测信号灵敏度较低。近年来，金纳米团簇(auncs)作为探针被广泛应用于生物检测和体内疾病监测，它们是一种约2nm的纳米材料，具有良好的荧光性能，被广泛用作信号探针。本研究拟通过大量生物信号分子偶联到auncs载体上，以auncs为载体，使其成为一种有吸引力的信号放大方法。然而，单一信号放大方法往往存在灵敏度低、选择性差、线性差等问题，且存在靶标本数量不足、相似生物分子导致信号减弱等问题。因此，一种方法的优点可以与另一种方法的优点合并，同时最大限度地减少两者的缺点。在生物检测方面，大多数研究报道将磁珠与其他纳米材料结合应用于抗原或其他生物分子的检测。
4、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为灵敏度和特异度较低，操作步骤繁琐、反应时间较长、标准化程度不理想等问题，因此快速、敏感、低成本的自身抗体标志物检测方法学研究将是未来需要解决的重点。目前纳米材料在生物医学领域的应用得到了广泛的关注，然而针对纳米材料在自身抗体检测中的应用知之甚少。因此本专利技术基于文献和试验基础，提供了一种基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统及方法。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统及方法。本专利技术的目的在于克服现有肿瘤标志物检测的灵敏度低，耗时耗力，成本高等问题，旨在提高检测的灵敏度、特异度和准确性。为癌症的早期筛查提供一种快速，灵敏和特异的新型检测方法。
2、本专利技术是这样实现的，一种基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统，所述基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统由磁珠偶联多肽(mb-peptide)作为捕获探针，合成的具有信号放大效应的金纳米团簇(anti-igg-hrp-auncs)作为检测探针，利用二者的组合实现高灵敏，高特异的自身抗体标志物检测。所述pdl1多肽的序列为seq id no:1：hgeedlkvqhssyrqr。
3、首先，通过ncbi下载pdl1蛋白相应的氨基酸序列(np_054862.1)，包含290个氨基酸；根据抗原多肽设计原则，最终确定pdl1多肽序列peptide seq id no:1：hgeedlkvqhssyrqr。
4、进一步，将设计的pdl1多肽表位与磁珠偶联作为捕获探针，并合成具有信号放大作用的hrp包覆的金纳米团簇，并将其与羊抗人igg结合作为检测探针；分别分析表征和性能。
5、本专利技术的另一目的在于提供一种基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法，所述基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法包括以下步骤：
6、s1，制备包覆hrp的金纳米团簇；
7、s2，用高碘酸钠(naio4)法将hrp-auncs与羊抗人igg偶联；
8、s3，在硝酸纤维素膜上分析斑点印迹免疫；
9、s4，测定合成的anti-igg-hrp-auncs的过氧化物酶的催化效率及亲和力；
10、s5，绘制人免疫球蛋白igg标准曲线，计算血浆中pdl1自身抗体的浓度。
11、进一步，所述步骤一具体包括：
12、s11，将haucl4(10mm，1ml)和hrp(100mg/ml，1ml)溶液混合，在37℃下轻轻搅拌10分钟；
13、s12，用1m氢氧化钠调节混合液的ph值至11，在37℃的水浴中轻轻搅拌24小时；
14、s13，反应混合物在4℃透析过夜，与等量的异丙醇混合，在8000rpm的条件下离心30分钟，重复3次；
15、s14，收集沉淀物，用等量的纯蒸馏水悬浮，得到包覆有hrp的金纳米团簇(hrp-auncs)的墨绿色溶液，并用bca法测定其浓度。
16、进一步，所述步骤二具体包括：
17、s21，将45μl 20mg/mlnaio4溶液加入500μl的5mg/mlhrp-auncs中，混合均匀，室温暗置20分钟；
18、s22，加入40μl乙二醇溶液，静置30分钟，在4℃的50mm碳酸盐缓冲液中透析过夜；
19、s23，将氧化后的hrp-auncs与羊抗人igg混合，室温透析2.5h；
20、s24，将交联产物从透析袋中取出，放入耐光容器中，加入80μl的硼氢化钠，在4℃下反应2小时，将还原液置于4℃的pbs缓冲液(10mm，ph7.2)中过夜透析，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统，其特征在于，由链霉亲和素磁珠偶联PDL1多肽作为捕获探针和山羊抗人IgG偶联辣根过氧化物酶包被金纳米团簇作为检测纳米探针组成，所述PDL1多肽的序列为SEQ ID NO:1：HGEEDLKVQHSSYRQR。
2.如权利要求1所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统，其特征在于，通过NCBI下载PDL1蛋白相应的氨基酸序列，包含290个氨基酸；根据抗原多肽设计原则，最终确定PDL1多肽序列peptide，SEQ ID NO:1：HGEEDLKVQHSSYRQR。
3.如权利要求1所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统，其特征在于，将设计的PDL1多肽表位与磁珠偶联作为捕获探针，并合成具有信号放大作用的HRP包覆的金纳米团簇，并将其与羊抗人IgG结合作为检测探针；分别分析表征和性能。
4.一种基于权利要求1所述的检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求1所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新
6.如权利要求4所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法，其特征在于，步骤二具体包括：
7.如权利要求4所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法，其特征在于，步骤三具体包括：
8.如权利要求1所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法，其特征在于，步骤四具体包括：
9.如权利要求4所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法，其特征在于，步骤五中绘制人免疫球蛋白IgG标准曲线，具体包括：
10.如权利要求4所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统的基于金纳米簇AuNCs的血浆自身抗体新型检测方法，其特征在于，步骤五中待测血浆样本中PDL1 AAb的检测是在与人免疫球蛋白标准曲线相同的平板上进行的，具体包括：
...【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统，其特征在于，由链霉亲和素磁珠偶联pdl1多肽作为捕获探针和山羊抗人igg偶联辣根过氧化物酶包被金纳米团簇作为检测纳米探针组成，所述pdl1多肽的序列为seq id no:1：hgeedlkvqhssyrqr。
2.如权利要求1所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统，其特征在于，通过ncbi下载pdl1蛋白相应的氨基酸序列，包含290个氨基酸；根据抗原多肽设计原则，最终确定pdl1多肽序列peptide，seq id no:1：hgeedlkvqhssyrqr。
3.如权利要求1所述的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测系统，其特征在于，将设计的pdl1多肽表位与磁珠偶联作为捕获探针，并合成具有信号放大作用的hrp包覆的金纳米团簇，并将其与羊抗人igg结合作为检测探针；分别分析表征和性能。
4.一种基于权利要求1所述的检测系统的基于金纳米簇的血浆自身抗体新型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求1所述的基于金纳米簇的血...
【专利技术属性】
技术研发人员：代丽萍，汪志，王修霞，王科妍，刘静静，杜仁乐，蔺薇薇，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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