【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种非典型新抗原的筛选方法，属于生物医学。
技术介绍
1、近年来，肿瘤免疫治疗领域的研究焦点之一在于如何有效识别并利用肿瘤新抗原，即那些仅在肿瘤细胞中表达、而非正常组织中存在的抗原，作为激发特异性免疫应答的目标。目前绝大部分新抗原识别流程筛选到的新抗原，主要是由体细胞dna的非同义单核苷酸变异（snvs）和小插入缺失（indels）产生的，称其为典型的新抗原。然而，越来越多的研究表明，除了dna突变产生的新抗原外，转录组的突变、蛋白质组的突变也是肿瘤新抗原的重要来源，而且这些新抗原还能高效地诱导t细胞产生强烈的免疫反应。这些非dna变异产生新抗原称其为非典型新抗原。
2、在此背景下，研究者们利用新技术、新方法已发现多种能产生新抗原的非dna变异。这些非dna变异包括但不限于：1.转录本可变剪接变异：基因的不同剪接方式可以产生具有不同序列的mrna，进而翻译成不同的蛋白质，这为新抗原的生成提供了额外途径；2.翻译后修饰：蛋白质在翻译后经过化学修饰（如磷酸化、糖基化等），可能改变其免疫原性，生成新表位；3.转座元件移动：如逆转录病毒元件的插入等，可导致基因组结构变化，产生独特抗原；4.非编码区变异：虽然不直接改变编码序列，但可能影响基因表达调控，间接促成新抗原的出现；这些非典型变异可能导致原本非编码的序列被翻译成蛋白质，或者影响蛋白质的翻译和修饰，从而产生新的免疫原性表位。与经典新抗原相比，非常规新抗原更频繁地在患者间共享，这为开发适用于更广泛人群的通用性免疫治疗药物提供了希望。例如，异常的剪接因子突变，如
3、然而非典型新抗原作为肿瘤免疫治疗中极具潜力的新方向，其筛选方法尚存在若干待解决问题。例如机制理解不全面：对于非典型新抗原形成的生物机制，如可变剪接、非编码区变异、翻译后修饰等过程。尽管有所了解，但具体机制和其在不同肿瘤类型中的差异性仍需更深入研究。这种机制层面的不明确，限制了针对性治疗策略的设计和实施。非dna变异识别：相关的研究已经表明选择性剪接变异、转座元件移动、非编码区变异、翻译后修饰等非典型变异能产生有效新抗原，由于对机制的研究不够，能准确、高效识别这些非典型变异的相关生物信息工具是严重缺乏的。非典型新抗原的优选：非典型新抗原如通过异常剪接产生的抗原，往往比因非同义突变形成的抗原更具免疫原性。然而，目前对于非典型新抗原的免疫原性评估方法不够完善，使得准确挑选非典型新抗原充满挑战。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种非典型新抗原的筛选方法，通过肿瘤患者的rna-seq数据，结合生物信息工具，利用有效的新抗原在序列上具有相似性的特点，同一种疾病在患者间存在共享新抗原。
2、实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种非典型新抗原的筛选方法，包括：
3、rna-seq的筛选步骤：获取肿瘤患者肿瘤组织的rna-seq和蛋白质组数据，对rna-seq数据进行筛选：去除含有测序接头的读数，去除质量分数＜15的碱基占比＞40％的读数以及含n碱基≥5的读数，读数的总gc碱基含量在：45-55%，读数的碱基质量值＞30的比例超过85%；
4、hla分型预测步骤：对hla-i类基因分型和hla-ii类基因分型进行预测；
5、基因转录本表达量量化步骤：以tpm定量公式(transcripts per million)=对转录本表达量量化；
6、转录本可变剪切突变检测步骤：判定外显子转变成内含子的剪切（exitronsplicing）事件和外显子-外显子连接（exon-exon junctions）事件；
7、rna编辑突变肽生成步骤：通过注释信息筛选非同义事件后，获得rna编辑位点；然后通过rna编辑位点对应选出候选肽，在编辑位点前后最多可包含十个氨基酸，以候选肽为依据，通过序列相似性获得rna编辑突变肽；
8、参考突变肽数据构建步骤：以转录本可变剪切突变检测步骤中获得的数据、rna编辑突变肽生成步骤中获得的数据、人类正常蛋白质序列和crap数据中的序列，构建参考突变肽数据库；
9、新抗原预测步骤：以参考突变肽数据库为基础，识别最大长度的肽为30个氨基酸，最小长度的肽为7个氨基酸，筛选候选新抗原；结合hla分型预测步骤获得的结果，获得候选新抗原与mhc i类的结合亲和力和对mhc ii类的结合亲和力；通过候选新抗原的排序，获得非典型新抗原。
10、进一步地，rna-seq的筛选步骤中，肿瘤患者肿瘤组织的rna-seq和蛋白质组数据量＞10g。
11、进一步地，hla分型预测步骤中，以optitype使用同源性判断的最优参数0.009作为条件对hla-i类基因分型进行预测。
12、进一步地，hla分型预测步骤中，以基于片段组装的预测方法对ii类基因分型进行预测。
13、进一步地，转录本可变剪切突变检测步骤中，判定exitron splicing事件的条件为：转录观测到的最低reads数量为3，reads比对到参考基因组的比对分数≥50，pso的最低阈值为0.05。
14、进一步地，转录本可变剪切突变检测步骤中，判定exon-exon junctions事件的条件为：支持连接的读数数量（junction-supportive read counts） ≥ 10、连接处的测序深度（read depth at the junction） ≥ 20且支持连接的读数频率（junction-supportiveread frequency）≥ 0.01。
15、进一步地，新抗原预测步骤中，使用netmhcpan预测候选新抗原与mhc i类的结合亲和力，然后使用netmhciipan预测候选新抗原对mhc ii类的结合亲和力。
16、进一步地，新抗原预测步骤中，以分数对候选新抗原进行排序，
17、分数=排名（rank）_bf*0.5+rank_pr*0.3+rank_bs*0.2；其中，bf为结合亲和力，bs为结合稳定性，pr为百分位秩分数。
18、进一步地，筛选方法还包括新抗原优选步骤：新抗原预测步骤得到的非典型新抗原与dbpepneo v2.0数据库中的实验验证的新抗原进行序列相似性比较，得到相似性≥90%的非典型新抗原。
19、进一步地，筛选方法还包括新抗原优选步骤：新抗原预测步骤后，对于与mhc i类分子结合的候选新抗原，以条件结合强度≤34nm、肿瘤基因表达丰度≥33tpm进行筛选。
20、相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
21、1、本专利技术通过肿瘤患者的rna-seq数据，结合生物信息工具，利用有效的新抗原在序列上具有相似性的特点，同一种疾病在患者间存在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，RNA-seq的筛选步骤中，肿瘤患者肿瘤组织的RNA-seq和蛋白质组数据量＞10G。
3.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，HLA分型预测步骤中，以Optitype使用同源性判断的最优参数0.009作为条件对HLA-I类基因分型进行预测。
4.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，HLA分型预测步骤中，以基于片段组装的预测方法对II类基因分型进行预测。
5.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，转录本可变剪切突变检测步骤中，判定外显子转变成内含子的剪切事件的条件为：转录观测到的最低reads数量为3，reads比对到参考基因组的比对分数≥50，PSO的最低阈值为0.05。
6.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，转录本可变剪切突变检测步骤中，判定外显子-外显子连接事件的条件为：支持连接的读数数量 ≥ 10、连接处的测序深度 ≥ 20且支持连接
7.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，新抗原预测步骤中，使用NetMHCpan预测候选新抗原与MHC I类的结合亲和力，然后使用NetMHCIIpan预测候选新抗原对MHC II类的结合亲和力。
8.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，新抗原预测步骤中，以分数对候选新抗原进行排序，
9.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，筛选方法还包括新抗原优选步骤：新抗原预测步骤得到的非典型新抗原与dbPepNeo v2.0数据库中的实验验证的新抗原进行序列相似性比较，得到相似性≥90%的非典型新抗原。
10.如权利要求9所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，对于与MHC I类分子结合的候选新抗原，以条件结合强度≤34nM、肿瘤基因表达丰度≥33TPM进行筛选。
...【技术特征摘要】
1.一种非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，rna-seq的筛选步骤中，肿瘤患者肿瘤组织的rna-seq和蛋白质组数据量＞10g。
3.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，hla分型预测步骤中，以optitype使用同源性判断的最优参数0.009作为条件对hla-i类基因分型进行预测。
4.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，hla分型预测步骤中，以基于片段组装的预测方法对ii类基因分型进行预测。
5.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，转录本可变剪切突变检测步骤中，判定外显子转变成内含子的剪切事件的条件为：转录观测到的最低reads数量为3，reads比对到参考基因组的比对分数≥50，pso的最低阈值为0.05。
6.如权利要求1所述的非典型新抗原的筛选方法，其特征在于，转录本可变剪切突变检测步骤中，判...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮润生，朱木春，张博越，
申请(专利权)人：广州润生细胞医药科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。