【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫检测领域，涉及一种多因子数字荧光免疫检测方法及其应用。
技术介绍
1、生物免疫检测技术是一种基于免疫学原理的检测方法，其核心在于抗原与抗体的特异性识别反应，该技术在医学诊断、生物学研究和生物工程等领域都有着广泛的应用。但随着生物技术的不断发展，生物免疫检测技术也在不断进步。数字荧光免疫检测是一种结合了免疫学和荧光检测技术的方法，可用于高灵敏度、高特异性的生物分子检测，其具有较高的灵敏度、高特异性、高通量及直观数字化表达。但目前大部分数字荧光检测都是针对单一抗体或蛋白的检测，如申请号为cn2024101885824的中国专利申请，其只能针对单一抗体或蛋白的检测，这就导致检测范围相对狭窄，无法同时检测多种抗体或蛋白，这在某些需要全面评估生物样本中多种分子含量的场景中可能显得不足，同时也导致检测成本较高，不适合大规模、高通量的筛查。因此需要开发一种多联检生物芯片，实现对多种免疫因子的高效联检，降低检测成本的同时缩短实验周期。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种多因子数字荧光生物芯片免疫检测方法。该方法具有一孔多检、成本低廉、操作简单、灵敏度高等优点。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、一种多因子数字荧光生物芯片免疫检测方法，具体步骤如下：
4、s1：制备基底；
5、s2.：制备荧光微球；
6、s3：制备待测生物标志物；
7、s4：制备生物芯片；
8、s5
9、进一步地，s1具体为：
10、s1.1：将pmma键合板用氮气吹干后放入等离子清洗机，plasma处理300s；
11、s1.2：在pmma键合板表面基底孔洞内加入50μl现配浓度为20mg/ml的edc和nhs混合溶液，置于室温震荡反应1小时活化；
12、s1.3：在pmma键合板表面基底孔洞内继续加入浓度为5mg/ml的il6抗体溶液25μl，10分钟后再滴加浓度为0.5mg/ml的crp抗体溶液，然后置于室温摇床2小时，之后用mes(2-morpholinoethanesulphonic acid))溶液清洗干净；
13、进一步地，s2具体为：
14、s2.1：取0.05ml橙色荧光微球悬浮液加入1ml mes溶液中，然后加入3.5μl edc溶液，漩涡混匀，再加入3.5μl nhs溶液，超声混匀，摇床1h；
15、s2.2：在15℃、20000g下离心10min，去除上清；
16、s2.3：加入1.5mlmes液，超声混匀，加入10微升crp抗体，摇床2h后在15℃、20000g下离心10min，去除上清；
17、s2.4：加入1.5mlmes溶液进行洗涤，洗涤后再次加入1.5mlmes溶液进行第二次洗涤。
18、s2.5：取0.05ml绿色荧光微球悬浮液加入1ml mes溶液中，然后加入3.5μl edc溶液，漩涡混匀，再加入33μl nhs溶液，超声混匀，摇床1h；
19、s2.6：在15℃、20000g下离心10min，去除上清；
20、s2.7：加入1.5mlmes液，超声混匀，加入10微升il6抗体，摇床2h后在15℃、20000g下离心10min，去除上清；
21、s2.8：加入1.5mlmes溶液进行洗涤，洗涤后再次加入1.5mlmes溶液进行第二次洗涤。
22、进一步地，s3具体为：
23、s3.1：配置浓度为200，400，800，1600ng/ml的crp溶液，溶剂为pbst。
24、s3.2：配置浓度为50，200，400，1600ng/ml的il-6溶液，溶剂为pbst。
25、进一步地，s4具体为：
26、s4.1：将s3.1得到的不同浓度crp溶液分别滴加进s1.3中的基底孔洞中；
27、s4.2：然后将s3.2得到的不同浓度il-6溶液再滴加进s4.1的孔洞中，摇床2小时；
28、s4.3：将s2.4中制备的橙色荧光微球及s2.8中制备的绿色荧光微球滴加进s4.2的孔洞内，每个孔洞都加入25微升橙色荧光微球及25微升绿色荧光微球，摇床2小时后用pbst溶液清洗干净并用氮气吹干。
29、进一步地，s5具体为：
30、将制备好的三明治夹心结构的样品置于显微镜载物台上，在荧光模块下，通过50倍物镜和ccd相机采集信号。采集的图像颗粒可视化程度高且分散性较好。通过imagej软件对图像中的高分子微球的成像数量进行统计分析，crp浓度与il6浓度分别为50，200，800，1600ng/ml及25，100，200，400ng/ml，其中crp微球成像数量分别为39，45，70，92；il6微球成像数量为2，12，26，68。线性分析所得数据图显示两种因子分布均匀且都具有很好的线性关系。
31、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
32、本专利技术采用的多因子检测技术(不低于2种因子)，既可以保证检测的可视化、灵敏度高、操作简单等优点，又可以实验一孔多检，降低成本及时间，在一些大规模化检测场景中实现对多种免疫因子的高效联检，降低检测成本的同时缩短实验周期，非常有利于市场的大规模化检测应用。
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1.一种多因子数字荧光生物芯片免疫检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
【技术特征摘要】
1.一种多因子数字荧光生物芯片免疫检...
【专利技术属性】
技术研发人员：何小波，张怡熳，唐继博，徐红星，
申请(专利权)人：河南省科学院物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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