【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学检测，涉及一种病原体的检测方法，特别涉及一种感染性心内膜炎相关病原体的检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、感染性心内膜炎(infectious endocarditis，ie)是由细菌、真菌、病毒等其他微生物直接感染心内膜、瓣膜、腱索及心内植入物等部位而引起的严重感染性疾病。ie感染后的特征性表现是瓣膜处赘生物形成，赘生物脱落后可进一步导致、重要器官栓塞、感染转移或脓毒血症等。ie临床上可表现为急性、亚急性或慢性。其中急性ie进展迅速，表现为突然高热、寒颤、败血症等全身并发症，且与脓毒血症难以鉴别，但出现新发的心脏杂音时，应诊断为急性ie。而亚急性ie诊断颇为困难。患者在数周至数月内可出现疲劳、呼吸困难或体重减轻等非特异性症状，并不都出现发热症状，且出现心脏杂音的不足半数。
2、近年来，各大医疗机构通过回顾性研究发现感染性心内膜炎在流行病学上随着时代的变迁而不断地发生变化，再次引起重视，并不断更新指南，但效果不甚理想。一方面是由于临床上诊断感染性心内膜炎的技术灵敏度不断提高，包括血培养，病理检查及超声心动图。另一方面是由于人们人生活水平提高，抗生素滥用的情况加剧，加快致病菌的变种及耐药性的进程，加之透析、人工瓣膜置换及心血管介入手术等侵入性有创的操作增多，大大增加感染几率。因此，开发一种可用于临床上感染性心内膜炎相关病原的检测方法研究对于ie的正确用药，以及合理的治疗方案制定具有十分重要的意义。
3、目前临床上针对ie的检测方法，主要有实验室检查，影像学检测，以及微生物学诊断。胆红素
4、与上述临床上ie的诊断方法不同，宏基因组二代测序(metagenomicsnext-generationsequencing，mngs)不依赖于目标微生物的分类或繁殖，检测微生物的范围更广泛。mngs相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高的准确性，并且大幅缩短了测序时间(只需48～72h)，与血培养及赘生物培养的检测时间相比也明显缩短(尤其对于苛养以及慢生长病原体的检测)，对于术前血培养阴性患者可根据赘生物mngs结果早期进行抗感染治疗。且mngs结果不受患者是否使用抗生素治疗的影响。有研究显示，相对于血培养和赘生物培养，mngs对于ie微生物的检出率更高。但是mngs的临床应用也存在一定的限制性，首先，其不能判断病原微生物的药敏情况，只能为诊断提供依据；其次，由于目前病原体的参考序列数据库尚未完善，分类方法也不统一，dna在环境中的广泛存在，以及所用试剂的多样性，使得mngs鉴定病原体变得更加复杂。值得注意的是，当mngs应用于临床诊断时，为确保结果的准确性、可重复性和可比性，对样本采集、核酸提取和数据分析等过程需进行标准化操作，实验流程复杂，且要求相对苛刻；因此，迫切需要一种高检出率、准确、快速、敏感的ie的检测方法，以便在患者出现临床症状前的早期确定感染性心内膜炎感染病例，实现感染性心内膜炎患者术后个体化、精准化的抗感染治疗。
5、
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种快速、便捷且灵敏度高的，可用于ie相关病原体检测方法的专用引物。
2、本专利技术所提供的用于ie相关病原体检测的专用引物，是选取各个病原种间特异、种内保守的基因或区域作为ie相关病原体检测的靶基因(包括gyrb基因，gro基因，nuc基因，及ddl基因)，选取能准确检测ie相关病原体(包括血链球菌、缓症链球菌、口腔链球菌、戈登链球菌、唾液链球菌、咽峡炎链球菌、变异链球菌、解没食子酸链球菌没食子酸亚种、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、缺陷乏养菌、毗邻颗粒链菌)，以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关耐药位点检测的目标序列，同时选择β珠蛋白基因(hemoglobin beta gene,hbb)作为内对照用于监测样本核酸提取情况。genbank数据库((https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载ie相关病原体作为参考序列的代表株基因序列，将参考序列与ncbi的nr数据库进行核酸序列blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，下载比对得到的结果，获取更多检测靶基因序列。使用引物设计软件针对上述分析得到的靶基因保守区域序列设计特异性的扩增引物与探针。经过多次尝试，最终获得能准确检测ie相关病原体的最佳引物与探针。使用ncbi提供的在线引物验证工具primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer blast/)对试剂进行评价，验证引物的特异性。
3、为此，本专利技术提供用于检测ie相关病原体的专用引物和探针，其特征在于，选自21套引物组与21个探针组成的组中的一组或多组，其中，所述21组引物组与21个探针的核苷酸序列为seq id no.1-seq id no.63所示；所述21套引物组与21个探针组成的组中每一组包括一对引物组和探针，一对引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。
4、其中，所述每一组包括一对引物组和探针，选自，seq id no.1-3；seq id no.4-6；seq id no.7-9；seq id no.10-12；seq id no.13-15；seq id no.16-18；seq id no.19-21；seq id no.22-24；seq id no.25-27；seq id no.28-30；seq id no.31-33；seq idno.34-36；seq id no.37-39；seq id no.40-42；seq id no.43-45；seq id no.46-48；seqid no.49-51；seq id no.52-54；seq id no.55-57；seq id no.58-60；seq id no.61-63中的一组或多组。
5、其中，seq id no.1-3中，seq id no.1为正向引物，seq id no.2为反向引物，seqid no.3为探针；seq id no.4-6中，seq id n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测IE相关病原体的专用引物和探针，其特征在于，选自21套引物组与21个探针组成的组中的一组或多组，其中，所述21组引物组与21个探针的核苷酸序列为SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.63所示；所述21套引物组与21个探针组成的组中每一组包括一对引物组和探针，一对引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。
2.根据权利要求1所述的专用引物和探针，其特征在于，其中，所述每一组包括一对引物组和探针，选自，SEQ ID NO.1-3；SEQ ID NO.4-6；SEQ ID NO.7-9；SEQ ID NO.10-12；SEQID NO.13-15；SEQ ID NO.16-18；SEQ ID NO.19-21；SEQ ID NO.22-24；SEQ ID NO.25-27；SEQ ID NO.28-30；SEQ ID NO.31-33；SEQ ID NO.34-36；SEQ ID NO.37-39；SEQ ID NO.40-42；SEQ ID NO.43-45；SEQ ID NO.46-48；SEQ ID NO.49-51；SEQ ID NO.5
3.根据权利要求2所述的专用引物和探针，其特征在于，其中，SEQ ID NO.1-3中，SEQID NO.1为正向引物，SEQ ID NO.2为反向引物，SEQ ID NO.3为探针；SEQ ID NO.4-6中，SEQID NO.4为正向引物，SEQ ID NO.5为反向引物，SEQ ID NO.6为探针；SEQ ID NO.7-9中，SEQID NO.7为正向引物，SEQID NO.8为反向引物，SEQ ID NO.9为探针；SEQ ID NO.10-12中，SEQ IDNO.10为正向引物，SEQ ID NO.11为反向引物，SEQ ID NO.12为探针；SEQID NO.13-15中，SEQ ID NO.13为正向引物，SEQ ID NO.14为反向引物，SEQID NO.15为探针；SEQ IDNO.16-18中，SEQ ID NO.16为正向引物，SEQ IDNO.17为反向引物，SEQ ID NO.18为探针；SEQ ID NO.19-21中，SEQ IDNO.19为正向引物，SEQ ID NO.20为反向引物，SEQ ID NO.21为探针；SEQID NO.22-24中，SEQ ID NO.22为正向引物，SEQ ID NO.23为反向引物，SEQIDNO.24为探针；SEQ ID NO.25-27中，SEQ ID NO.25为正向引物，SEQ IDNO.26为反向引物，SEQ ID NO.27为探针；SEQ ID NO.28-30中，SEQ IDNO.28为正向引物，SEQ ID NO.29为反向引物，SEQ ID NO.30为探针；SEQID NO.31-33中，SEQ ID NO.31为正向引物，SEQ ID NO.32为反向引物，SEQID NO.33为探针；SEQ ID NO.34-36中，SEQ ID NO.34为正向引物，SEQIDNO.35为反向引物，SEQ ID NO.36为探针；SEQ ID NO.37-39中，SEQ IDNO.37为正向引物，SEQ ID NO.38为反向引物，SEQ ID NO.39为探针；SEQID NO.40-42中，SEQ ID NO.40为正向引物，SEQ ID NO.41为反向引物，SEQID NO.42为探针；SEQ ID NO.43-45中，SEQ ID NO.43为正向引物，SEQ IDNO.44为反向引物，SEQ ID NO.45为探针；SEQ ID NO.46-48中，SEQIDNO.46为正向引物，SEQ ID NO.47为反向引物，SEQ ID NO.48为探针；SEQID NO.49-51中，SEQ ID NO.49为正向引物，SEQ ID NO.50为反向引物，SEQID NO.51为探针；SEQ ID NO.52-54中，SEQ ID NO.52为正向引物，SEQ IDNO.53为反向引物，SEQ ID NO.54为探针；SEQ IDNO.55-57中，SEQ IDNO.55为正向引物，SEQ ID NO.56反向引物，SEQ ID NO.57为探针；SEQIDNO.58-60中，SEQ ID NO.58为正向引物，SEQ ID NO.59为反向引物，SEQ IDNO.60为探针；SEQ ID NO.61-63中，SEQ ID NO.61为正向引物，SEQ IDNO.62为反向引物，SEQ ID NO.63为探针。
【技术特征摘要】
1.用于检测ie相关病原体的专用引物和探针，其特征在于，选自21套引物组与21个探针组成的组中的一组或多组，其中，所述21组引物组与21个探针的核苷酸序列为seq idno.1-seq id no.63所示；所述21套引物组与21个探针组成的组中每一组包括一对引物组和探针，一对引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。
2.根据权利要求1所述的专用引物和探针，其特征在于，其中，所述每一组包括一对引物组和探针，选自，seq id no.1-3；seq id no.4-6；seq id no.7-9；seq id no.10-12；seqid no.13-15；seq id no.16-18；seq id no.19-21；seq id no.22-24；seq id no.25-27；seq id no.28-30；seq id no.31-33；seq id no.34-36；seq id no.37-39；seq id no.40-42；seq id no.43-45；seq id no.46-48；seq id no.49-51；seq id no.52-54；seq idno.55-57；seq id no.58-60；seq id no.61-63中的一组或多组。
3.根据权利要求2所述的专用引物和探针，其特征在于，其中，seq id no.1-3中，seqid no.1为正向引物，seq id no.2为反向引物，seq id no.3为探针；seq id no.4-6中，seqid no.4为正向引物，seq id no.5为反向引物，seq id no.6为探针；seq id no.7-9中，seqid no.7为正向引物，seqid no.8为反向引物，seq id no.9为探针；seq id no.10-12中，seq idno.10为正向引物，seq id no.11为反向引物，seq id no.12为探针；seqid no.13-15中，seq id no.13为正向引物，seq id no.14为反向引物，seqid no.15为探针；seq idno.16-18中，seq id no.16为正向引物，seq idno.17为反向引物，seq id no.18为探针；seq id no.19-21中，seq idno.19为正向引物，seq id no.20为反向引物，seq id no.21为探针；seqid no.22-24中，seq id no.22为正向引物，seq id no.23为反向引物，seqidno.24为探针；seq id no.25-27中，seq id no.25为正向引物，seq idno.26为反向引物，seq id no.27为探针；seq id no.28-30中，seq idno.28为正向引物，seq id no.29为反向引物，seq id no.30为探针；seqid no.31-33中，seq id no.31为正向引物，seq id no.32为反向引物，seqid no.33为探针；seq id no....
【专利技术属性】
技术研发人员：彭俊平，李晓东，孙立莹，雷雅娟，
申请(专利权)人：岛津企业管理中国有限公司，
类型：发明
国别省市：
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