【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疾病动物模型构建方法，具体涉及一种circrere基因敲除小鼠模型构建方法和应用。
技术介绍
1、流行病学研究资料表明，青光眼是导致视力丧失的主要病因之一，其发病率仅次于白内障，青光眼患者人数预计将在2040年超过1.1亿。青光眼是一组以视网膜神经节细胞不可逆性死亡和视野缺损为特征，威胁和损伤视神经及视觉功能的疾病，病理性高眼压是主要临床特征及危险因素。目前唯一有效的青光眼临床治疗方法是用过药物或者手术降低眼压以预防视力丧失，但无法阻止视网膜神经节细胞丢失对视觉功能的影响。
2、青光眼动物模型极大提高了多青光眼疾病机制和进展的研究，并有助于药物靶标的发现。尽管这些模型在某些方面不同程度的模拟了人类青光眼疾病的发病机制，但是仍有不足之处。当前某一种动物模型只能从某一方面或某几个方面来模拟人类青光眼，不能完全用来研究人类青光眼疾病的临床发病机制。因此，如何基于青光眼的临床特点，构建与临床表现和人体发病机制一致的动物模型仍然是目前研究的重点和难点。
3、由于青光眼在人类中与眼压水平明显相关，青光眼动物模型主要利用升高眼压进行造模，这也是目前应用较多的方法。但大多对动物本身的房水循环影响较大，因此得到的高眼压模型不太理想，主要是造成急性的高眼压模型，对于更接近模拟人类原发性青光眼的持续性慢性高眼压动物模型制作较为困难。高眼压不能完全代表所有类型青光眼的临床特征，研究逐渐发现青光眼发病机制核心研究对象是具有特征性视神经病变视网膜神经节细胞及其轴突的损害，因此直接损伤视神经或视网膜的动物模型也被广泛应用
4、但是，如何获得一种具有青光眼表型的动物模型，是本领域亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供了一种circrere基因敲除小鼠动物模型及其构建方法和应用。
2、专利技术人基于对青光眼遗传学特征的深入认识以及转基因技术的应用，通过敲除小鼠circrere基因建立自发性小鼠青光眼模型，从基因层面了解青光眼的发病机制，更有助于揭示人类青光眼的病理损伤机制及探索抗青光眼治疗的新方法。
3、为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案。
4、一种circrere基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其包括下述步骤：
5、利用sgrna对小鼠的circrere的基因进行敲除，获得circrere基因敲除小鼠。
6、本专利技术中，sgrna是指小向导rna(single guide rna，sgrna)，是crispr/cas9基因编辑系统的重要组成部分，包含目标序列(crrna)和一段cas9核酸酶识别序列(tracrrna)，在crispr/cas9编辑系统中发挥准确识别靶基因序列的作用。
7、本专利技术一些实施例中，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、本专利技术一些实施例中，所述sgrna1和sgrna2质量比为1:1。
9、本专利技术一些实施例中，根据circrere基因序列，针对circrere基因4号染色体敲除partial intron 4，敲除环状rna上游的sine元件，预测可在不影响线性基因表达的情况下影响环状rna表达。
10、本专利技术一些实施例中，将cas9 mrna与构建的sgrna1、sgrna2共同注射到小鼠受精卵细胞核中，产生靶向敲除小鼠，即f0代小鼠。
11、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12、本专利技术中，所述cas9 mrna的作用是，在受精卵中翻译cas9蛋白，之后cas9蛋白在sgrna的引导下剪切基因组dna分子。
13、本专利技术一些实施例中，所述sgrna浓度为100pmol/μl。
14、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna翻译后的cas9蛋白浓度为250ng/μl。
15、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna与sgrna1质量比为(1-2):1。
16、本专利技术一些实施例中，所述cas9 mrna与sgrna2质量比为(1-2):1。
17、本专利技术对鼠的来源没有特殊限定，例如可以采用常规基因敲除使用的c57bl/6j。
18、本专利技术一优选实施例中，所述circrere基因敲除小鼠动物模型的构建方法包括如下步骤：
19、(1)通过http://crispor.tefor.net/网站构建针对circrere基因的sgrna：所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2所示；
20、(2)将cas9 mrna与构建的sgrna1、sgrna2共同注射到小鼠受精卵细胞核中，产生靶向敲除小鼠，即f0代小鼠；
21、(3)提取f0代小鼠尾部dna，通过pcr鉴定并进行序列分析敲除结果；
22、(4)将f0代小鼠与wt野生型小鼠杂交，进行种系传代获得f1代小鼠，经pcr鉴定纯合子即为circrere基因敲除小鼠模型。其中，seq id no.1：ctatttgctgggttgggcgagggseqid no.2：acttagtgttaccatccgaagggseq id no.3：
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27、
28、本专利技术还提供一种基于crispr/cas9基因敲除技术构建circrere基因敲除小鼠模型的sgrna，包括sgrna1和sgrna1，所述sgrna1如seq id no:1所示，所述sgrna2如seq idno:2所示。
29、本专利技术还提供了一种circrere基因打靶载体，所述载体是基于crispr/cas9系统的sgrna表达载体，sgrna的作用位点的序列如seq id no:1和seq id no:2所示。
30、本专利技术还提供了一种前述的sgrna在构建青光眼相关的基因敲除小鼠动物模型中的用途。
31、本专利技术还提供了一种通过上述构建方法构建得到的circrere基因敲除小鼠动物模型在研究青光眼疾病机理上的应用。
32、本专利技术还提出了一种上述构建方法构建得到的circrere基因敲除小鼠动物模型在筛选靶向治疗青光眼的药物中的应用。
33、本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
34、本专利技术的有益效果是：
35、本专利技术使用crispr/cas9基因敲除技术，敲出了小鼠circrna基因circrere。所获得小鼠均表现出明显的视网膜厚度变薄，视网膜神经节细胞(gcl)丢失，视功能损伤等青光眼表型。可以为青光眼发病机制的研究，药物和临床治疗策略的筛选提供简单、可靠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种circRERE基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，其包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA1和sgRNA2质量比为1:1。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，根据circRERE基因序列，针对circRERE基因4号染色体敲除Partial intron 4，敲除环状RNA上游的SINE元件。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，将Cas9 mRNA与构建的sgRNA1、sgRNA2共同注射到小鼠受精卵细胞核中，产生靶向敲除小鼠，即F0代小鼠；
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA浓度为100pmol/μL；
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA与sgRNA1质量比为(1-2):1；和
8.一种通过如权利要求1-7中任一项所述的构建方法构建得到的circRERE基因敲除小鼠动物模型在研究青光眼疾病机理上的应用。
9.一种通过如权利要求1-7中任一项所述的构建方法构建得到的circRERE基因敲除小鼠动物模型在筛选靶向治疗青光眼的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种circrere基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，其包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq idno.2所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna1和sgrna2质量比为1:1。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，根据circrere基因序列，针对circrere基因4号染色体敲除partial intron 4，敲除环状rna上游的sine元件。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，将cas9 mr...
【专利技术属性】
技术研发人员：计丹，杨倩，游梦玲，李海波，周学智，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：
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