【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于crispr-cas9系统的运载体领域，涉及一种基于相分离体系的可响应crispr-cas9系统的载体及其构建方法和应用。
技术介绍
1、crispr/cas9基因编辑工具源自细菌免疫系统，哺乳细胞中并不存在。同时，外源性获取或者制备的cas9蛋白和grna无法自主进入细胞。因此，如何快速、准确、高效地将crispr系统递送进入细胞并实现基因编辑是面临的挑战性问题。目前，crispr/cas9系统的递送可分为基于质粒、rna和蛋白质这3种水平的递送。cas9和sgrna能够被编码在病毒载体的质粒dna中。然而，递送质粒会降低基因编辑效率，延长cas9蛋白切割时间从而使脱靶率增加，另外还有基因整合风险等。此外，递送编码cas9蛋白的mrna和sgrna的局限性在于mrna本身稳定性差且在体内和体外都易受到rna酶的降解。递送cas9蛋白和sgrna是最直接简便的方法，该形式无转录和翻译过程，基因编辑更快速高效，脱靶率低且毒性小。然而，该递送形式的难点在于cas9蛋白质为正电性大分子，而sgrna为负电性分子，组成的复合物rnp尺寸较大不易包封，细胞膜通透性差。
2、现有文献报道了几种传递cas9蛋白的策略，如机械方法包括电穿孔和膜变形提供直接输送，阳离子脂质体等运送方式，但这些策略都受到cas9和sgrna内体包裹的影响，并且它们需要专门的处理并且通常不便于活体治疗应用([1]schumann,k.；lin,s.；boyer,e.；et al.generation of knock-in primary
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种易于合成、可控、细胞毒性低的基于相分离体系的可响应crispr-cas9系统的载体及其构建方法和应用。
2、实现本专利技术目的的技术方案如下：
3、基于相分离体系的可响应crispr-cas9系统的载体，为多肽rnp颗粒，其为微米级别，由带有核定位信号(nsl)的cas9蛋白、对目的基因响应的sgrna及带有正电荷的阳离子多肽组成，所述的带有正电荷的阳离子多肽的氨基酸序列为rraslrrasl(seq id no.1)；所述的带有核定位信号cas9蛋白与对目的基因响应的sgrna形成带有负电的复合物rnp，再与带有正电荷的阳离子多肽组成多肽rnp颗粒；所述的多肽rnp颗粒设有可磷酸化的丝氨酸位点，蛋白激酶a(pka)可以将该位点磷酸化，从而改变多肽的电荷，实现复合物rnp的释放。
4、优选地，核定位信号的氨基酸序列为pkkkrkv(seq id no.2)。
5、上述基于相分离体系的可响应crispr-cas9系统的载体的制备方法，包括如下步骤：
6、将等摩尔的cas9蛋白和sgrna混合在含有的atp的溶液中，37℃孵育5～10min，使csa9与sgrna络合成rnp，然后将阳离子多肽与rnp在37℃下混合并发生相分离，形成液滴状颗粒溶液，获得运载rnp的载体多肽rnp颗粒。
7、优选地，阳离子多肽与rnp的混合时间为30min以上。
8、优选地，cas9和sgrna的终浓度均为200nm，阳离子多肽的终浓度为200μm。
9、优选地，rnp与阳离子多肽的摩尔比为1:1000。
10、优选地，含有的atp的溶液可以为由20mm hepes、2.5mm atp、1.5mm二硫苏糖醇(dithiothreitol)组成的ph＝7.4的缓冲溶液，或者由20mm tris、2.5mm atp、1.5mm二硫苏糖醇组成的ph＝7.4的缓冲溶液。
11、进一步地，本专利技术提供上述载体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用，通过该载体将crispr系统递送进入细胞并实现基因编辑。
12、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
13、本专利技术的基于相分离体系的crispr-cas9系统的载体具有易于合成和设计、生物相容性和稳定性良好的特点，本专利技术的crispr-cas9系统的载体具有较小的细胞毒性和较高的可控性和稳定性，多肽rnp颗粒上设有丝氨酸位点，其可作为磷酸化位点被蛋白激酶a磷酸化，从而改变多肽的电荷，实现对rnp的释放，从而快速、准确、高效地将crispr系统递送进入细胞并实现基因编辑。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.基于相分离体系的可响应CRISPR-Cas9系统的载体，其特征在于，为微米级别的多肽RNP颗粒，由带有核定位信号的Cas9蛋白、对目的基因响应的sgRNA及带有正电荷的阳离子多肽组成，所述的带有正电荷的阳离子多肽的氨基酸序列为RRASLRRASL。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，核定位信号的氨基酸序列为PKKKRKV。
3.根据权利要求1或2所述的载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的载体的制备方法，其特征在于，阳离子多肽与RNP的混合时间为30min以上。
5. 根据权利要求3所述的载体的制备方法，其特征在于，Cas9和sgRNA的终浓度均为200 nM，阳离子多肽的终浓度为200 μM。
6.根据权利要求3所述的载体的制备方法，其特征在于，RNP与阳离子多肽的摩尔比为1:1000。
7. 根据权利要求3所述的载体的制备方法，其特征在于，含有的ATP的溶液为由20mMHEPES、2.5 mM ATP、1.5 mM 二硫苏糖醇组成的pH=7.4的缓冲溶液，或者由2
8.根据权利要求1或2所述的载体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.基于相分离体系的可响应crispr-cas9系统的载体，其特征在于，为微米级别的多肽rnp颗粒，由带有核定位信号的cas9蛋白、对目的基因响应的sgrna及带有正电荷的阳离子多肽组成，所述的带有正电荷的阳离子多肽的氨基酸序列为rraslrrasl。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，核定位信号的氨基酸序列为pkkkrkv。
3.根据权利要求1或2所述的载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的载体的制备方法，其特征在于，阳离子多肽与rnp的混合时间为30min以上。
5. 根据权利要求3所述的载...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。