基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法及差异代谢物代谢通路技术

技术编号：42822404 阅读：19 留言：0更新日期：2024-09-24 20:59

本发明专利技术提供了一种基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法及差异代谢物代谢通路，所述研究方法包括采用超高效液相色谱串联质谱检测分析六味地黄汤治疗孤独症小鼠粪便中内源性代谢产物，获得色谱图；利用多元统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出110个发生显著变化的内源性代谢物，作为与六味地黄汤治疗孤独症的潜在相关差异代谢物；并通过数据库富集得到与六味地黄汤治疗孤独症小鼠相关的重要代谢途径；所述研究手段探究六味地黄汤治疗孤独症过程中相关的代谢变化，从微观角度揭示治疗孤独症过程中六味地黄汤所调控的相关代谢物及异常代谢网络。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药，尤其是基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法及差异代谢物代谢通路。

技术介绍

1、孤独症是一种由遗传和环境因素引起的神经发育障碍性疾病，其致病原因尚未明确，症状复杂，异质性极强，它的风险基因在很大程度都是未知，且孤独症的治疗周期漫长，见效缓慢，是需要迫切解决的公共卫生问题。目前并没有针对孤独症核心症状的有效治疗办法，现用的药物有效性较低且具有一定的副作用，因此，寻找孤独症发生发展过程中的标志性代谢物及阐明有着确切疗效的药物的作用机制对孤独症的早期诊断、预防及治疗有着重要意义。

2、代谢组学作为新兴技术，已广泛应用于寻找疾病生物标志物和关键代谢途径、解释疾病机制，能够通过多个学科技术的交叉互助，利用现代技术定量分析机体所有代谢物，明确不同代谢模式下代谢物的变化，探究这些代谢物与机体病理生理的关系，综合评价给药前后生物体液中小分子代谢物轮廓的改变，寻找药物干预前后差异代谢物以判断药物对病理机体的作用，评价或预测药物疗效。其中，粪便代谢物作为肠道菌和宿主共代谢的产物，检测粪便中的代谢产物，能够提供丰富的代谢组学信息，反映宿主机体以及肠道菌的状态。

3、六味地黄汤在古方中被用来治疗小儿的“五迟”“五软”症，即小儿生长发育障碍性疾病。目前文献多报道六味地黄汤治疗神经退行性病变疾病阿尔兹海默症，关于六味地黄汤对孤独症发挥药理作用的研究并不多见，六味地黄汤治疗孤独症作用机制的粪便代谢组学研究未见报道，包括它对哪些异常的代谢网络进行了调节，以及其作用机制有待深入阐明。

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技术实现思路

1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法。

2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供应用上述研究方法获得的差异代谢物代谢通路。

3、一种基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，步骤如下：

4、(1)采用超高效液相色谱串联质谱检测分析六味地黄汤治疗孤独症小鼠的粪便内源性代谢产物，获得色谱图；

5、(2)利用多元统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出110个发生显著变化的内源性代谢物，作为与六味地黄汤治疗孤独症的潜在相关差异代谢物；

6、(3)通过数据库富集得到与六味地黄汤治疗孤独症小鼠相关的重要代谢途径。

7、优选的，上述基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，通过如下具体步骤获得六味地黄汤治疗孤独症的差异代谢物代谢通路：

8、(1)六味地黄汤浸膏的制备

9、将熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻药材以水浸泡煎煮，过滤提取液，滤液经减压回收纯水并干燥得到六味地黄汤浸膏；

10、(2)建立孤独症小鼠模型：

11、(3)动物分组、剂量设置及给药方法

12、将步骤(2)中得到的孤独症小鼠(8周雄性ko小鼠)随机分为模型组(ko-kb)、六味地黄汤给药组(ko-gy)，加上正常对照组(雄性wt小鼠)，共3组，以灌胃方式持续干预2-4周，其中，六味地黄汤组给予步骤(1)获得的六味地黄汤浸膏水溶液，对照组和模型组给予相同体积的生理盐水；

13、(4)小鼠粪便的采集、保存和前处理

14、利用代谢笼收集各组小鼠的24小时粪便，保存于2ml的冻存管中，液氮速冻后于-80℃冰箱保存；称取粪便每80mg，加入200μl内标溶液，加入冰冷乙腈/水，然后用组织研磨机匀浆，之后在冰水浴中超声，离心，吸取上清液过滤膜后于自动进样瓶中，待进样分析；

15、(5)超高效液相色谱串联质谱检测分析

16、建立超高效液相色谱串联质谱技术，对各组小鼠粪便样本依次进行液质联用数据采集；

17、(6)数据预处理

18、质谱数据导入progenesis qi软件(美国waters公司)，进行试验分组，峰提取界面参数设置(保留时间、加合离子形式等)，对所有数据进行归一化和解卷积处理，以获得初步的代谢组学数据矩阵；

19、(7)多元统计分析及生物标志物鉴定

20、为了筛选出六味地黄汤对孤独症小鼠的干预过程中有显著变化的差异代谢物，将预处理后的数据导入到ezinfo软件(美国waters公司)，首先对所有组别进行无监督的主成分分析，为进一步确证六味地黄汤对孤独症小鼠的干预效果，将模型组和六味地黄汤给药组进行有监督的正交偏最小二乘法判别分析，同时构建s-plot图，再将数据转移到progenesis qi进行显著性分析，以筛选差异代谢物作为潜在的生物标志物，并利用数据库以潜在生物标志物所对应的分子量及二级碎片进行化合物鉴定，最终可鉴定出110个与六味地黄汤治疗孤独症进程相关的差异代谢产物；

21、(8)代谢通路富集分析

22、将筛选鉴定出的潜在生物标志物导入integrated molecular pathway levelanalysis数据库，找到最相关的代谢途径，共富集得到36条代谢通路，其中排名靠前的代谢通路为色氨酸代谢通路和相关的雌激素代谢通路。

23、优选的，上述基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(1)中六味地黄汤浸膏的制备方法为：称取熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻药材以质量比8∶4∶4∶3∶3∶3的比例加入圆底烧瓶中，加入6～10倍量水浸泡10～50min，文火煮沸持续1～4h，提取液过滤，药渣再加入3～9倍量水文火煮沸，持续1～4h，提取液过滤，混合两次提取液，滤液经温度50-55℃、真空度0.001-0.01mpa减压回收纯水，浓缩至稠膏状，所得浓缩液进行干燥，得到六味地黄汤浸膏，于4℃冰箱保存备用。

24、优选的，上述基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(3)中六味地黄汤浸膏水溶液以100-500mg/kg进行灌胃。

25、优选的，上述基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(4)中小鼠各组粪便样本每80mg加入200μl内标溶液，加入冰冷乙腈/水(3∶1，v/v)溶液800μl，然后在无菌管中加入粒径为5mm和3mm的钢珠各一颗，并用组织研磨机在60hz下均质120s，之后在冰水浴中超声处理10min，在4℃、15000r·min-1离心15min，得到上清液，经0.22μm微孔膜过滤。

26、优选的，上述基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(4)中内标溶液的制备方法为：精密称取亮氨酸脑啡肽1mg，加入1ml甲醇溶液超声溶解，得到1mg·ml-1质量浓度的亮氨酸脑啡肽储备液；再次精密吸取适量亮氨酸脑啡肽储备液，加入甲醇稀释，得到质量浓度为10μg·ml-1的内标溶液，于4℃冰箱中保存备用。

27、优选的，上述基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：通过如下具体步骤获得六味地黄汤治疗孤独症的差异代谢物代谢通路：

3.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(1)中六味地黄汤浸膏的制备方法为：称取熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻药材以质量比8：4：4：3：3：3的比例加入圆底烧瓶中，加入6～10倍量水浸泡10～50min，文火煮沸持续1～4h，提取液过滤，药渣再加入3～9倍量水文火煮沸，持续1～4h，提取液过滤，混合两次提取液，滤液经温度50-55℃、真空度0.001-0.01Mpa减压回收纯水，浓缩至稠膏状，所得浓缩液进行干燥，得到六味地黄汤浸膏，于4℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(3)中六味地黄汤浸膏水溶液以100-500mg/k

5.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(4)中内标溶液的制备方法为：精密称取亮氨酸脑啡肽1mg，加入1mL甲醇溶液超声溶解，得到1mg·mL-1质量浓度的亮氨酸脑啡肽储备液；再次精密吸取适量亮氨酸脑啡肽储备液，加入甲醇稀释，得到质量浓度为10μg·mL-1的内标溶液，于4℃冰箱中保存备用。

6.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(5)中超高效液相色谱条件为：色谱柱为Shim-packGIST C18柱；保护柱为Shim-pack GIST-HP(G)C18，柱温设置为40℃，流动相A为水，B为乙腈，流动相流速为0.2mL·min-1，梯度洗脱程序为0-7min，5-45％B；7-14min，45-95％B；14-15.5min，95％B；15.5-16min，95-5％B；16-20min，5％B；自动进样室温度设为4℃，进样量为2μL；所述步骤(5)中质谱条件为所有数据在电喷雾离子源正、负离子以MSE模式进行全扫描采集，其中毛细管电压-2.5kV，锥孔电压40V，源偏移80V，离子源温度100℃，脱溶剂温度400℃，锥孔气50L/h，脱溶剂气800L/h；离子扫描范围为50-1000m/z；扫描时间0.2s；低碰撞能量6eV；高碰撞能量10-40eV；按照流速15μL/min持续注入亮氨酸脑啡肽溶液对QTOF进行校正。

7.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(6)中进行数据预处理的主要数据处理参数如下：保留时间范围0-20min，质量数范围80-1000Da，设置加合离子形式，包括正离子选择M+H、M+Na、M+NH4，负离子选择M-H、M+HCOOH。

8.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(7)中差异代谢物的筛选条件为：选择变量重要性投影值≥1，且差异在两组间具有统计学意义：t检验p Value＜0.05。

9.一种基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路，其特征在于：所述代谢通路为：

10.根据权利要求9所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路，其特征在于：所述差异代谢物为：

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【技术特征摘要】

1.一种基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：步骤如下：

3.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(1)中六味地黄汤浸膏的制备方法为：称取熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻药材以质量比8：4：4：3：3：3的比例加入圆底烧瓶中，加入6～10倍量水浸泡10～50min，文火煮沸持续1～4h，提取液过滤，药渣再加入3～9倍量水文火煮沸，持续1～4h，提取液过滤，混合两次提取液，滤液经温度50-55℃、真空度0.001-0.01mpa减压回收纯水，浓缩至稠膏状，所得浓缩液进行干燥，得到六味地黄汤浸膏，于4℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(3)中六味地黄汤浸膏水溶液以100-500mg/kg进行灌胃；所述步骤(4)中小鼠各组粪便样本每80mg加入200μl内标溶液，加入冰冷乙腈/水溶液800μl，然后在无菌管中加入粒径为5mm和3mm的钢珠各一颗，并用组织研磨机在60hz下均质120s，之后在冰水浴中超声处理10min，在4℃、15000r·min-1离心15min，得到上清液，经0.22μm微孔膜过滤。

5.根据权利要求2所述的基于代谢组学的六味地黄汤治疗孤独症差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(4)中内标溶液的制备方法为：精密称取亮氨酸脑啡肽1mg，加入1ml甲醇溶液超声溶解，得到1mg·ml-1质量浓度的亮氨酸脑啡肽储备液；再次精密吸取适量亮氨酸脑啡肽储备液，加入甲醇稀释，得到质量浓度为10μg·ml-1的内标溶液，于4℃冰箱中保存备用。

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【专利技术属性】
技术研发人员：刘静，邢红，李越，陈晓鹏，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人