【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学检测，具体涉及一种rt-raa-lfd检测猫杯状病毒的引物与探针组合及应用。
技术介绍
1、猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)是一种单股正链无囊膜的rna病毒，属于杯状病毒科水杯状病毒属。该病毒在世界范围内广泛流行，在猫科动物中具有较高的感染性和传播性，传播途径主要包括接触感染性患猫的口、鼻分泌物、带毒环境等。猫杯状病毒感染主要引起口腔、上呼吸道症状，临床症状主要表现为发热、食欲下降、精神沉郁；口腔发炎，出现溃疡，口腔黏膜发红、溃烂，舌上出现溃疡并伴随红肿，牙龈红肿、出血、萎缩，牙齿松动、脱落；眼部红肿，结膜炎，分泌物增多。鼻部有分泌物，打喷嚏，严重时发生肺部感染。猫杯状病毒与其他引起猫呼吸系统的病原在临床症状上难以区分，并且猫杯状病毒常与其他病原混合感染，发展为猫上呼吸道感染综合症，给疾病的诊断和治疗带来困难。
2、目前对猫杯状病毒常见的诊断方法主要包括：病毒分离鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附试验、荧光定量pcr等。但病原的分离鉴定耗时过长、成本较高，不利于在临床诊疗中快速得到检测结果；血清中和试验和酶联免疫吸附试验具有成本低、易操作的优点，但容易产生假阴性及假阳性结果，精准性有待进一步提高；荧光定量pcr反应迅速、灵敏度高、特异性强，但该方法对检测试剂、检测设备以及人员要求较高。以上这些缺点使得这些检测方法局限于实验室，不能满足基层宠物医院需求。
3、raa技术是一种新型常温核酸快速扩增技术，可以从多种病原微生物的核酸中扩增靶基因，包括rna、mirna、
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种rt-raa-lfd检测猫杯状病毒的引物与探针组合，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。
2、进一步，所述探针和引物序列修饰如下：探针的5’端标记一个fam荧光基团，3’端标记一个c3 spacer荧光基团，探针的第32位为脱碱基位点。
3、本专利技术还提供一种rt-raa-lfd检测猫杯状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物和探针组合。本专利技术还提供了一种rt-raa-lfd检测猫杯状病毒的方法，包括如下步骤：
4、以待测样品的基因组rna为模板，利用所述引物和探针组合进行raa扩增，采用侧流层析试纸对raa扩增产物进行检测。
5、进一步，所述raa扩增体系为50μl，其中，再水化缓冲液29.4μl、上游引物2μl、下游引物2μl、探针0.6μl、醋酸镁溶液2.5μl、模板2μl、余量为无菌水。
6、进一步，所述raa扩增条件为水浴32～47℃反应4～20min。
7、优选地，所述raa扩增条件为水浴42℃反应8min。
8、本专利技术还提供了所述的引物与探针组合在制备检测猫杯状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
9、本专利技术相对于现有技术的有益效果在于：
10、rt-raa-lfd是反转录raa结合侧流层析试纸条建立的一种现场快速检测方法。该技术操作简单，对实验人员的操作技能要求低，有利于基层工作人员开展大量检测；对实验设备的要求低，恒温条件下发生反应，水浴锅即可完成，检测结果可视化，摆脱了实验室精密仪器的依赖，可在基层实现便携式工作；rt-raa-lfd技术中采用一步法反应，反转录和raa扩增反应发生在单管中，速度比两步法更快，而且需要较少的准备和操作时间，首先特殊修饰的反转录酶利用特异性引物和模板rna合成cdna链，然后以新合成的cdna链为模板进行快速核酸扩增反应；产物滴加在侧向层析试纸条上即可显示检测结果，整个检测过程不超过30分钟，与其他检测技术相比，大大缩短了操作时间。
11、本专利技术提供了一种rt-raa-lfd检测猫杯状病毒的引物与探针组合，该引物与探针组合是经过筛选获得。利用该引物与探针组合，本专利技术开发了一种猫杯状病毒rt-raa-lfd快速检测方法，可快速现场检测猫杯状病毒，经过验证，具有特异性好，灵敏度高，反应十分快速的优点，为猫杯状病毒的体外诊断提供了可用的快速检测方法。
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1.一种RT-RAA-LFD检测猫杯状病毒的引物与探针组合，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的引物与探针组合，其特征在于，所述探针和引物序列修饰如下：探针的5’端标记一个FAM荧光基团，3’端标记一个C3 spacer荧光基团，探针的第32位为脱碱基位点。
3.一种RT-RAA-LFD检测猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针组合。
4.一种用于检测猫杯状病毒的RT-RAA-LFD方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样品的基因组RNA为模板，利用权利要求1的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧流层析试纸对RAA扩增产物进行检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在冻干酶粉中加入再水化缓冲液29.4μL、上游引物2μL、下游引物2μL、探针0.6μL、醋酸镁溶液2.5μL、模板2μL，加入无菌水至50μL。
6.根据权
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA-LFD扩增条件为水浴42℃反应8min。
8.权利要求1或2所述的引物与探针组合在制备检测猫杯状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种rt-raa-lfd检测猫杯状病毒的引物与探针组合，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。
2.根据权利要求1所述的引物与探针组合，其特征在于，所述探针和引物序列修饰如下：探针的5’端标记一个fam荧光基团，3’端标记一个c3 spacer荧光基团，探针的第32位为脱碱基位点。
3.一种rt-raa-lfd检测猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针组合。
4.一种用于检测猫杯状病毒的rt-raa-lfd方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样品...
【专利技术属性】
技术研发人员：高艳春，王海燕，李彦伟，兰康，宋相阳，鲍雅萱，孙盼盼，
申请(专利权)人：北京科牧丰生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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