【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因与细胞治疗领域，具体涉及基因敲除的免疫细胞及其应用。
技术介绍
1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是一种人工合成的受体，由胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域组成。car分子一般通过基因转染或病毒感染等递送方式导入免疫细胞，如t细胞、自然杀伤细胞(nk细胞)等，从而分别得到car-t或car-nk细胞。car-t或car-nk细胞在与癌细胞表面对应的抗原接触后可被显著激活，并产生大量效应因子，从而杀伤肿瘤细胞。
2、car-t和car-nk细胞治疗均属于细胞免疫治疗。目前用于血液肿瘤细胞免疫治疗的常见肿瘤抗原靶点有cd19、bcma、cd5、cd20等；而用于实体肿瘤细胞免疫治疗的常见肿瘤抗原靶点有msln、cldn18.2、gpc3、cea等。以人cd19抗原为例，它是一个大小为95kd的跨膜糖蛋白，是正常b细胞和b系淋巴瘤细胞的表面标志分子，可被用作b型急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病和弥漫大b淋巴瘤等的细胞免疫治疗抗原靶点。全球至今已经有8款car-t疗法获批上市，均是用于治疗血液肿瘤，包括急性淋巴性白血病、弥漫大b淋巴瘤和多发性骨髓瘤等。
3、当前car-t治疗的主要挑战仍是car-t细胞在肿瘤治疗中的功能耗竭、存活时间短以及不能有效浸润实体肿瘤等。对于如何改善以上car-t方面的问题，增强car-t的疗效，目前已有通过调控pd-1信号通路来改善car-t功能的多项研究。car-t细胞表面表达pd-1分子，可以识别肿瘤细胞表面的pd
4、crispr-cas9基因编辑技术可以实现在哺乳动物中高效且特异的基因编辑。它主要包含cas9和sgrna(single guide rna)两种成分。当将cas9和靶向目的基因的sgrna同时导入细胞，可以实现对目的基因的高效敲除。目前已有十多项在car-t中敲除pd-1并回输入肿瘤病人体内进行治疗的临床研究。然而，由于基于pd-1为靶点治疗的有效性有限，目前仅有约20％的肿瘤病人对以pd-1为靶点的药物治疗方式起作用。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了基因敲除的免疫细胞及其应用。
2、本专利技术提供了基因敲除的免疫细胞及其应用。本专利技术展示了在car-t细胞中实现对人itk基因的高效敲除。本专利技术展示了在car-t细胞中敲除itk，可以降低car-t细胞的耗竭并延长car-t细胞的存活。本专利技术展示了使用itk的抑制剂可以降低car-t细胞的耗竭并延长car-t细胞的存活；本专利技术展示了itk敲除的car-t细胞在小鼠肿瘤模型内可以实现更好的扩增优势，以及更长期的肿瘤控制效果。本专利技术展示了itk敲除或抑制介导的car-t细胞的耗竭降低，与car分子携带的抗原识别结构域无关。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
4、本专利技术提供了itk基因的敲除和/或抑制在如下任意项中的应用：
5、(i)、减少免疫细胞的凋亡；和/或
6、(ii)、降低免疫细胞的耗竭；和/或
7、(iii)、延长免疫细胞的存活；和/或
8、(iv)、利于免疫细胞的扩增。
9、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述免疫细胞包括但不限于自体的car-t细胞或异体移植的car-t细胞。
10、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述car-t细胞中的car分子包括但不限于结合人cd19抗原的car分子和/或表达结合人gd2抗原的car分子。
11、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述人cd19抗原的car分子包括人cmv、cd8αsp、anti-cd19-scfv、cd8αhinge、cd8αtm、cd28、4-1bb和cd3ζ。
12、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述人gd2抗原的car分子包括人cmv、cd8αsp、anti-gd2-scfv、cd8αhinge、cd8αtm、cd28、4-1bb和cd3ζ。
13、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述人cd19抗原的car分子包括：
14、(ⅰ)、如seq id no.1所示核苷酸序列；或
15、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
16、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
17、(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
18、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述人gd2抗原的car分子包括：
19、(ⅰ)、如seq id no.2所示核苷酸序列；或
20、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
21、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
22、(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
23、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述cd8αsp包括：
24、(ⅰ)、如seq id no.3所示核苷酸序列；或
25、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
26、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
27、(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
28、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述anti-cd19-scfv包括：
29、(ⅰ)、如seq id no.9所示核苷酸序列；或
30、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
31、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
32、(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.ITK基因的敲除和/或抑制在如下任意项中的应用：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括但不限于自体的CAR-T细胞或异体移植的CAR-T细胞；
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述敲除的方法包括但不限于基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑方法。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述CRISPR/Cas9系统基因编辑方法包括但不限于：电转sgRNA-Cas9蛋白复合物进入宿主，得到ITK基因敲除的宿主。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述宿主包括CAR-T细胞。
6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述敲除使用的sgRNA包括：
7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制的方法包括但不限于ITK的小分子抑制剂和/或siRNA基因敲降。
8.如权利要求1至7任一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子包括IFN-γ、TNF或GranzymeB中的一种或多种。
9.ITK敲除或抑制的免疫细胞在制备预
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括非实体瘤和实体瘤；
11.如权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括但不限于自体的CAR-T细胞或异体移植的CAR-T细胞；
12.如权利要求9至11任一项所述的应用，其特征在于，所述敲除的方法包括但不限于基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑方法。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，利用所述CRISPR/Cas9系统基因编辑方法包括但不限于：电转sgRNA-Cas9蛋白复合物进入宿主，得到ITK基因敲除的宿主。
14.如权利要求12或13所述的应用，其特征在于，所述宿主包括CAR-T细胞。
15.如权利要求12至14任一项所述的应用，其特征在于，所述敲除使用的sgRNA包括：
16.如权利要求9至15任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制的方法包括但不限于ITK的小分子抑制剂和/或siRNA基因敲降。
17.药物，其特征在于，包括ITK敲除或抑制的免疫细胞。
18.药物组合，其特征在于，包括如权利要求17所述的药物以及其他任意有效成分。
19.治疗疾病的方法，其特征在于，其包含向受试者施用以下任意项：
...【技术特征摘要】
1.itk基因的敲除和/或抑制在如下任意项中的应用：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括但不限于自体的car-t细胞或异体移植的car-t细胞；
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述敲除的方法包括但不限于基于crispr/cas9系统的基因编辑方法。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述crispr/cas9系统基因编辑方法包括但不限于：电转sgrna-cas9蛋白复合物进入宿主，得到itk基因敲除的宿主。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述宿主包括car-t细胞。
6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述敲除使用的sgrna包括：
7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制的方法包括但不限于itk的小分子抑制剂和/或sirna基因敲降。
8.如权利要求1至7任一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子包括ifn-γ、tnf或granzymeb中的一种或多种。
9.itk敲除或抑制的免疫细胞在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅征，黄伟珊，韩连斌，武莹，
申请(专利权)人：苏州镁伽科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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