【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及一种植物源口服免疫的手足口病疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、手足口病(hand,foot and mouth disease，hfmd)为多种人肠道病毒感染所致的传染性疾病，主要患病人群为五岁以下儿童，导致患儿的手掌、脚掌和口腔黏膜中出现水疱，并呈现出较强的空间聚集性，易引起暴发流行，严重影响儿童健康。目前并没有专门针对手足口病毒感染的抗病毒药物面世，所以扩大疫苗接种覆盖率是控制该病的主要方法。
2、在引起手足口病的病原体之中，最为常见的是肠道病毒71(enterovirus 71，ev71)和柯萨奇病毒a16(coxsackievirusa16，ca16)。目前中国已经批准针对ev71的灭活疫苗上市，由ev71引起的手足口病患儿数量得到控制，但尚无针对ca16病毒的疫苗。未接种疫苗的婴幼儿接触到可以经由飞沫传染的病毒仍存在较高的患病风险。虽然ev71病毒与ca16病毒同属于小rna病毒科，但二者感染会引发不同的抗病毒免疫反应，这导致在部分手足口病患者中，存在两种病毒交叉感染或者频繁共存的现象。针对目前ca16病毒感染病例逐年上涨的趋势，亟需研发针对ca16病毒的疫苗，以及同时针对ca16病毒与ev71病毒的二价疫苗。
3、同时，由于手足口病的患者多为婴幼儿，注射型疫苗存在一定的操作风险，且难免造成被免疫者刺痛或者哭闹的现象，降低儿童对于疫苗的接受程度和接种率。
技术实现思路
1、为解决市面上缺少更易于为儿童接种免疫的针对c
2、本专利技术的技术方案：
3、一种植物源口服免疫的手足口病疫苗，所述疫苗的有效成分为植物源重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白由重组抗原基因ctb-ev71-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:1所示；或由重组抗原基因ctb-ca16-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:2所示；或由重组抗原基因ctb-ev71+ca16-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:3所示；或由重组抗原基因vhh-ev71-vp编码，其氨基酸序列如seq id no:4所示；或由重组抗原基因vhh-ev71-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:5所示；或由重组抗原基因cpp-ev71-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:6所示。
4、进一步的，疫苗的成分还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括奶粉、奶油或葡萄糖。
5、一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，包括如下步骤：
6、步骤一、将含有重组抗原基因的质粒与含有植物高效表达载体的质粒双酶切后连接，构建含有重组抗原基因和植物高效表达载体的重组质粒，并将所得重组质粒转化大肠杆菌感受态；
7、步骤二、从大肠杆菌扩繁菌液中提取含有重组抗原基因的重组质粒并转化根癌农杆菌；
8、步骤三、采用注射法以步骤二所得转化成功的根癌农杆菌侵染模式植物；
9、步骤四、从侵染后的模式植物中提取植物总蛋白，纯化、透析后获得重组免疫蛋白，进而获得植物源口服免疫的手足口病疫苗。
10、进一步的，步骤一所述重组抗原基因的基本结构为在pacⅰ和notⅰ双酶切位点之间依次为口服免疫佐剂元件的编码基因、连接核苷酸序列linker、抗原基因和his标签。
11、进一步的，所述口服免疫佐剂元件的编码基因为霍乱毒素b亚基ctb、纳米抗体vhh或细胞穿膜肽cpp的编码基因；所述抗原基因为ev71-vp1和/或ca16-vp1。
12、进一步的，步骤一所述植物高效表达载体质粒为pjl-trbo质粒。
13、进一步的，步骤二采用冻融法将含有重组抗原基因的重组质粒转化到根癌农杆菌。
14、进一步的，步骤三所述模式生物为烟草。
15、进一步的，步骤三所述注射法是将od600为0.5～0.8的根癌农杆菌重悬菌液用1ml注射器从烟草叶片下表皮的划痕伤口处注射到烟草叶片内，直至叶片呈现出湿润状态。
16、进一步的，步骤四所述纯化采用镍柱亲和层析进行，洗涤杂蛋白时，向纯化柱中分别加入2倍柱体积的含有20mm、50mm、80mm咪唑的pbs溶液；洗脱重组抗原蛋白时，向纯化柱中分别加入2倍柱体积的含有200mm、300mm、500mm咪唑的pbs溶液。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术基于手足口病最常见的两种致病病毒ev71病毒和ca16病毒的抗原决定簇与三种口服疫苗免疫佐剂霍乱毒素b亚单位ctb、纳米抗体vhh和细胞穿膜肽cpp设计了六种hfmd重组抗原基因，并借助植物生物反应器生产出可经由黏膜直接吸收的重组抗原蛋白，进而获得了六种手足口病疫苗，其中包括四种单独针对ev71病毒的疫苗，一种单独针对ca16病毒的疫苗，以及一种同时针对ev71病毒和ca16病毒的二价疫苗，填补了市面上手足口病疫苗针对ca16病毒的空白。
19、试验证实，本专利技术获得的六种重组抗原蛋白在口服条件下均能够诱导小鼠体内的黏膜免疫和体液免疫反应，具备口服疫苗的免疫原性，解决了目前市面上针对手足口病只有注射型疫苗的问题，能够显著增强儿童对于手足口病疫苗的接受程度，提高接种率，抑制致病病毒的传播。
20、本专利技术提供的制备方法借助植物生物反应器实现重组抗原蛋白的高效生产，解决了目前植物生物反应器外源蛋白生产效率低的问题。植物生物反应器在价格低廉的同时，能够提供准确的翻译和修饰，并且不产生内毒素或污染，满足疫苗生产的安全性要求。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种植物源口服免疫的手足口病疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分为植物源重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白由重组抗原基因CTB-EV71-VP1编码，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示；或由重组抗原基因CTB-CA16-VP1编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或由重组抗原基因CTB-EV71+CA16-VP1编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或由重组抗原基因VHH-EV71-VP编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或由重组抗原基因VHH-EV71-VP1编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或由重组抗原基因CPP-EV71-VP1编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗，其特征在于，疫苗的成分还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括奶粉、奶油或葡萄糖。
3.一种权利要求1或2所述植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤一所
5.根据权利要求4所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，所述口服免疫佐剂元件的编码基因为霍乱毒素B亚基CTB、纳米抗体VHH或细胞穿膜肽CPP的编码基因；所述抗原基因为EV71-VP1和/或CA16-VP1。
6.根据权利要求3-5任一所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤一所述含有植物高效表达载体的质粒为pJL-TRBO质粒。
7.根据权利要求6所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二采用冻融法将含有重组抗原基因的重组质粒转化到根癌农杆菌。
8.根据权利要求7所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤三所述模式生物为烟草。
9.根据权利要求8所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤三所述注射法是将OD600为0.5～0.8的根癌农杆菌重悬菌液用1mL注射器从烟草叶片下表皮的划痕伤口处注射到烟草叶片内，直至叶片呈现出湿润状态。
10.根据权利要求9所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤四所述纯化采用镍柱亲和层析进行，洗涤杂蛋白时，向纯化柱中分别加入2倍柱体积的含有20mM、50mM、80mM咪唑的PBS溶液；洗脱重组抗原蛋白时，向纯化柱中分别加入2倍柱体积的含有200mM、300mM、500mM咪唑的PBS溶液。
...【技术特征摘要】
1.一种植物源口服免疫的手足口病疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分为植物源重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白由重组抗原基因ctb-ev71-vp1编码，其氨基酸序列如seqid no:1所示；或由重组抗原基因ctb-ca16-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:2所示；或由重组抗原基因ctb-ev71+ca16-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:3所示；或由重组抗原基因vhh-ev71-vp编码，其氨基酸序列如seq id no:4所示；或由重组抗原基因vhh-ev71-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:5所示；或由重组抗原基因cpp-ev71-vp1编码，其氨基酸序列如seq id no:6所示。
2.根据权利要求1所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗，其特征在于，疫苗的成分还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括奶粉、奶油或葡萄糖。
3.一种权利要求1或2所述植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述一种植物源口服免疫的手足口病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤一所述重组抗原基因的基本结构为在pacⅰ和notⅰ双酶切位点之间依次为口服免疫佐剂元件的编码基因、连接核苷酸序列linker、抗原基因和his标签。
5.根据权利要求4所述一种植物源口服免疫的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王傲雪，马生武，张羽昕，张瑶，王文飞，陈秀玲，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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