【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外转录领域，尤其涉及一种能提高多聚腺苷酸尾巴稳定性的质粒骨架。
技术介绍
1、mrna疫苗，是将合成的编码蛋白质抗原的mrna序列注入人体内，指导机体表达相应的蛋白质，并诱导机体激发特异性免疫应答，达到疾病预防和治疗的目的。与传统疫苗相比，具有免疫原性强、安全性高且易研发与生产等多个优点。
2、polya尾巴是真核生物mrna上的一个重要的特征，由多个腺苷酸组成，位于mrna的3’端。它在基本表达调控中扮演着重要的角色，特别是在翻译和控制mrna稳定性方面。polya尾巴可以防止外切核酸酶对mrna 3’末端的降解，增加mrna的稳定性。此外，在翻译过程中，polya尾巴可以起到“翻译增强子”的作用。研究表明，去除polya位点，mrna表达水平的降低最高可达10倍。
3、目前通过ivt合成mrna时，polya尾巴的添加方式主要有以下3种：一是酶法合成，mrna转录完成后添加源自大肠杆菌的polya聚合酶；二是共转录，由已经存在于模板质粒dna或者pcr产物上的polya序列直接转录形成；三是使用phi29 dna聚合酶，体外滚环扩增(rca)技术扩增质粒。其中共转录加尾能保持终产物的同质性，减少工艺步骤，节约成本，成为大家更偏好的方法。也有些科学家另辟蹊径，选用分段式的polya共转录法，它可以降低polya的缺失。
4、mrna质粒dna模板的制备通常选择细菌发酵方式进行规模化生产质粒，但在细菌扩增过程中，携带较长的聚均核苷酸序列的质粒的polya尾巴可能会随着细菌的不断
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种能提高多聚腺苷酸尾巴稳定性的质粒骨架。本专利技术通过人工改造建立了低拷贝的pmrvacsl和中拷贝的pmrvacm质粒载体系统，由于pmrvacsl是低拷贝载体，质粒dna产量较低。pmrvacm质粒骨架解决了pmrvacsl质粒dna产量较低的问题。该载体系统不仅能使150bp以上的polya尾巴序列保持稳定复制，且能快速添加感兴趣的基因和多聚腺苷酸(polya)序列，高效快递的得到目标的mrna体外转录的dna模板。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了表达盒，依次包括：rop基因、复制子ori和抗性基因；
4、所述rop基因、所述复制子ori和所述抗性基因之间通过连接片段连接。
5、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒，从5’端到3’端，依次包括：rop基因、复制子ori和抗性基因；
6、所述rop基因、所述复制子ori和所述抗性基因之间通过连接片段连接。
7、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述rop基因包括野生型或突变型；所述突变型经所述野生型通过如下任意项后获得；
8、(i)、去除起始密码子；或
9、(ii)、将起始密码子突变为终止密码子。
10、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述rop基因具有：
11、(1)、如seq id no:1至seq id no:3任意所示的核苷酸序列；或
12、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
13、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％、85％、90％或95％同一性的核苷酸序列。
14、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:1的序列为：
15、
16、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:2的序列为：
17、
18、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:3的序列为：
19、
20、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述复制子ori包括：野生型或突变型；所述突变型经所述野生型的核苷酸序列第442位突变后获得。
21、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述突变型包括经所述野生型的核苷酸序列第442位的g突变为a。
22、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述复制子ori具有：
23、(4)、如seq id no:4或seq id no:5所示的核苷酸序列；或
24、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
25、(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％、85％、90％或95％同一性的核苷酸序列。
26、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:4的序列为：
27、
28、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:5的序列为：
29、
30、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述抗性基因包括：卡那霉素抗性基因。
31、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述卡那霉素抗性基因的序列如seqid no:11所示：
32、
33、
34、
35、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述连接片段具有：
36、(7)、如seq id no:6至seq id no:10任意所示的核苷酸序列；或
37、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
38、(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％、85％、90％或95％同一性的核苷酸序列。
39、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:6的序列为：
40、
41、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:7的序列为：
42、
43、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:8的序列为：
44、
45、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:9的序列为：
46、
47、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，seq id no:10的序列为：
48、
49、在本专利技术的一些实施方案中，上述表达盒中，所述连接片段包括：连接片段1～连接片段4；
50、所述连接片段1位于所述rop基因的5’端；
51、所述连接片段2位于所述rop基因和所述复制子ori之间；
52、所述连接片段3位本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.表达盒，其特征在于，依次包括：rop基因、复制子ori和抗性基因；
2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述rop基因包括野生型或突变型；所述突变型经所述野生型通过如下任意项后获得；
3.如权利要求1或2所述的表达盒，其特征在于，所述rop基因具有：
4.如权利要求1至3任一项所述的表达盒，其特征在于，所述复制子ori包括：野生型或突变型；所述突变型经所述野生型的核苷酸序列第442位突变后获得。
5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述突变型包括经所述野生型的核苷酸序列第442位的G突变为A。
6.如权利要求1至5任一项所述的表达盒，其特征在于，所述复制子ori具有：
7.如权利要求1至6任一项所述的表达盒，其特征在于，所述抗性基因包括：卡那霉素抗性基因。
8.如权利要求1至7任一项所述的表达盒，其特征在于，所述连接片段具有：
9.如权利要求1至8任一项所述的表达盒，其特征在于，所述连接片段包括：连接片段1～连接片段4；
10.重组质粒，其特征在于，包括：如
11.宿主，其特征在于，转化和/或转染如权利要求10所述的重组质粒。
12.如权利要求1至9任一项所述的表达盒、如权利要求10所述的重组质粒和/或如权利要求11所述宿主在如下任意项中的应用；
13.产品，其特征在于，包括：如权利要求1至9任一项所述的表达盒、如权利要求10所述的重组质粒和/或如权利要求11所述的宿主。
...【技术特征摘要】
1.表达盒，其特征在于，依次包括：rop基因、复制子ori和抗性基因；
2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述rop基因包括野生型或突变型；所述突变型经所述野生型通过如下任意项后获得；
3.如权利要求1或2所述的表达盒，其特征在于，所述rop基因具有：
4.如权利要求1至3任一项所述的表达盒，其特征在于，所述复制子ori包括：野生型或突变型；所述突变型经所述野生型的核苷酸序列第442位突变后获得。
5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述突变型包括经所述野生型的核苷酸序列第442位的g突变为a。
6.如权利要求1至5任一项所述的表达盒，其特征在于，所述复制子ori具有：
7.如权利要求1至6任一项所述的表达盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒙伟能，卓美玲，王秋积，刘晨，谢贤，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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