【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于慢性肾病治疗领域，更特别地，涉及基于lyve1的肾脏增殖淋巴管内皮细胞敲除小鼠的构建方法。
技术介绍
1、慢性肾脏病(ckd)是各种肾脏疾病持续进展的共同结局，是影响公众健康的重要疾病。肾脏损伤过程中免疫反应持续激活，导致大量炎症细胞浸润，直接导致肾脏实质细胞损伤或者导致成纤维细胞激活，从而促进肾脏纤维化迁延不愈，最终进展为终末期肾脏病，但免疫反应激活的确切机制还不清楚。
2、因此,目前缺乏能够有效治疗的慢性肾病的药物.
技术实现思路
1、申请者在前期的研究中发现：多种原因导致的肾脏损伤发生后，肾脏和肾周淋巴结内存在显著的淋巴管新生，这些新生的淋巴管主要来源于肾脏固有淋巴管内皮细胞的增殖。这些新生淋巴管的对于肾脏免疫调控和肾脏损伤的意义或扮演的角色还不清楚，通过白喉毒素部分敲除lyve1-dtr小鼠淋巴管内皮细胞，引起肾周淋巴结、脾脏免疫反应减弱，肾脏炎症细胞浸润减少，肾脏纤维化改善，但存在靶向性不足，器官特异性不强的问题。
2、为解决上述问题，本专利技术提供了基于淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(lyve1)的肾脏增殖淋巴管内皮细胞敲除小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、s1：构建打靶载体，所述打靶载体中包含单纯疱疹病毒胸苷激酶控制的lyve1同源重组片段(lyve1-tk)；
4、s2：通过显微注射将所述打靶载体及cri spr/cas9系统注射至小鼠受精卵中，通过cre-l oxp系统获得带有lyve1-t
5、在一个具体实施方案中，所述lyve1同源重组片段的同源重组位点位于lyve1基因的第三内含子及3’utr中。
6、在一个具体实施方案中，包括两个sgrna，其中5’端的sgrna序列如seq id no:6所示，3’端的sgrna序列如seq id no:12所示。
7、在一个具体实施方案中，s2包括以下步骤：
8、1)f l oxed纯合子小鼠(f l/f l)与全身性表达的cre小鼠(ue-cre+)交配，获得cre阳性的全身性基因敲除杂合子小鼠(△/+,ue-cre+)；
9、2)将步骤1)得到的目的鼠与野生鼠(wt)交配获得基因敲除通过种系遗传，同时去除cre的小鼠(△/+,ue-cre-)；
10、3)将步骤2)得到的目的鼠互相交配得到全身基因敲除的纯合子小鼠(△/△,ue-cre-)。
11、本专利技术通过向lyve1-tk小鼠肾脏内注射适量更昔洛韦，并采用单侧肾动脉结扎模型诱导肾脏损伤，观察到更昔洛韦靶向敲除lyve1-tk小鼠肾脏内增殖的淋巴管内皮细胞后，损伤肾脏的淋巴管系统得到特异性下调。结果显示，损伤肾脏内的免疫反应显著减轻，炎症细胞浸润程度明显降低，肾脏纤维化程度得到改善。我们进一步在单侧肾脏缺血再灌注模型以及血清肾毒性肾炎模型中验证了这一结论，结果与主要实验一致。这些发现揭示了肾脏淋巴管新生在慢性肾脏病免疫调控和肾脏损伤中的重要作用，为未来通过调控该途径来延缓慢性肾脏病进展提供了新的基础。
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1.基于淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(Lyve1)的肾脏增殖淋巴管内皮细胞敲除小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Lyve1同源重组片段的同源重组位点位于Lyve1基因的第三内含子及3’UTR中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括两个sgRNA，其中5’端的sgRNA序列如SEQ ID NO:6所示，3’端的sgRNA序列如SEQ ID NO:12所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.基于淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(lyve1)的肾脏增殖淋巴管内皮细胞敲除小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述lyve1同源重组片段的同源重组位点位于lyve1基因的第三内含子及3’utr中。...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐钢，曾锐，裴广畅，吴剑亮，胡丹妮，徐鑫，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：
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