【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，特别是涉及一种生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、人乳低聚糖（hmos）是继乳糖和脂肪之后，人乳中含量第三丰富的成分，其具有重要的生物学功能。乳糖-n-新四糖（lnnt）是人乳低聚糖最核心的组分之一，是一种公认安全（gras）的食品添加剂，是继2’-岩藻糖基乳糖之后第二种在婴儿配方奶粉中商业添加的人乳低聚糖，其具有增强人体免疫力、调节肠道菌群、加速伤口愈合等生物学功能。
2、乳糖-n-新四糖的商业化生产方法主要包括化学合成和生物合成，生物合成已通过大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等模式菌实现。目前，以大肠杆菌为宿主构建乳糖-n-新四糖的合成途径的方法主要包括：敲除大肠杆菌基因组中的lacz基因，同时使大肠杆菌表达β-1,3-n-葡糖氨基酶编码基因lgta和β-1,4-半乳糖转移酶编码基因lgtb，从而实现乳糖-n-新四糖的从头合成。例如，zhang mengwei等人通过敲除大肠杆菌基因组中的lacz、laca、nagb、gcd、ugd、wecb以及seta基因，并增强galu、galel、gtb、prs、lacy等基因的表达，从而整体强化udp-gal和udp-glcnac的合成；cn115851570a记载了通过敲除大肠杆菌基因组中的lacz、wcaj和nudd基因，并过表达lgta、gale和特定来源的β-1,4半乳糖基转移酶基因，从而提高lnnt的产量。但是上述的乳糖-n-新四糖的生物合成方法中仍然存在一些不足限制了产物的高效合成。
3、因此，传统的乳糖-n-
技术实现思路
1、基于此，本申请一个或多个实施例提供了一种生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌及其构建方法与应用。技术方案包括：
2、根据本申请实施例的第一方面，提供了一种生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌，所述基因工程菌外源表达：
3、（1）sec信号肽；和
4、（2）糖基转移酶，所述糖基转移酶包括β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶。
5、在其中一个实施例中，所述sec信号肽与所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的n端连接，两者进行共表达。
6、在其中一个实施例中，所述sec信号肽与所述β-1,4-半乳糖基转移酶的n端连接，两者进行共表达。
7、在其中一个实施例中，所述sec信号肽包括dsba信号肽、dacd信号肽、ompa信号肽、pelb信号肽、male信号肽、lamb信号肽和fadl信号肽中的一种或多种。
8、在其中一个实施例中，满足如下条件中的一个或者多个：
9、（1）编码所述pelb信号肽的核苷酸序列如seq id no:1或者seq id no:2所示；
10、（2）编码所述dsba信号肽的核苷酸序列如seq id no:3所示；和
11、（3）编码所述ompa信号肽的核苷酸序列如seq id no:4所示。
12、在其中一个实施例中，所述糖基转移酶满足如下条件中的一个或者多个：
13、（1）编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的核苷酸序列如seq id no:5所示；和
14、（2）编码β-1,4-半乳糖基转移酶的核苷酸序列如seq id no:6所示。
15、在其中一个实施例中，所述基因工程菌包括细菌；
16、可选地，所述细菌包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的一种或多种；
17、可选地，所述基因工程菌的基因组中的wcaj基因、lacz基因、fucik基因、nana基因、nank基因、nane基因和nant基因中的一种或者多种失活或缺失；
18、进一步可选地，所述基因工程菌的基因组中的wcaj基因、lacz基因和fucik基因失活或缺失。
19、根据本申请实施例的第二方面，提供了如上述任一项的生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
20、将编码所述sec信号肽和所述糖基转移酶的核酸片段导入底盘细胞，构建所述基因工程菌。
21、根据本申请实施例的第三方面，提供了一种乳糖-n-新四糖的制备方法，包括如下步骤：
22、对上述任一项的基因工程菌进行发酵培养，制备乳糖-n-新四糖。
23、根据本申请实施例的第四方面，提供了一种乳制品的生产方法，包括如下步骤：
24、采用上述的制备方法制备乳糖-n-新四糖；以及，
25、使用所述乳糖-n-新四糖制备乳制品。
26、与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：
27、本申请的申请人通过大量研究发现，将sec信号肽以及乳糖-n-新四糖合成途径所需糖基转移酶（β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶）的编码片段同时转入基因工程菌中，sec信号肽与其中一种糖基转移酶共表达使其分泌表达至周质空间，增强该蛋白的表达效率，同时实现乳糖-n-新四糖合成途径的中间产物和终产物分区域合成，最终提升乳糖-n-新四糖的产率。
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1.一种生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌外源表达：
2.根据权利要求1所述的生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述Sec信号肽与所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的N端连接，两者进行共表达。
3.根据权利要求1所述的生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述Sec信号肽与所述β-1,4-半乳糖基转移酶的N端连接，两者进行共表达。
4.根据权利要求1~3任一项所述的生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述Sec信号肽包括DsbA信号肽、DacD信号肽、OmpA信号肽、pelB信号肽、MalE信号肽、LamB信号肽和FadL信号肽中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌，其特征在于，满足如下条件中的一个或者多个：
6.根据权利要求1~3中任一项所述的生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述糖基转移酶满足如下条件中的一个或者多个：
7.根据权利要求1~3中任一项所述的生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌，其特征在
8.如权利要求1~7任一项所述的生产乳糖-N-新四糖的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.一种乳糖-N-新四糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.一种乳制品的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌外源表达：
2.根据权利要求1所述的生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述sec信号肽与所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的n端连接，两者进行共表达。
3.根据权利要求1所述的生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述sec信号肽与所述β-1,4-半乳糖基转移酶的n端连接，两者进行共表达。
4.根据权利要求1~3任一项所述的生产乳糖-n-新四糖的基因工程菌，其特征在于，所述sec信号肽包括dsba信号肽、dacd信号肽、ompa信号肽、pelb信号肽、male信号肽、lamb信号肽和fadl信号肽中的一种或...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆姝欢，刘玲，李翔宇，李慕梓，刘洋，
申请(专利权)人：嘉必优生物技术武汉股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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