【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因，尤其涉及一种双免疫细胞源性囊泡制备方法及其在抗肿瘤中的应用
技术介绍
1、肝癌是癌症第六大高发的恶性肿瘤，高居癌症死亡率第四位，且发病率一直居高不下。肝癌的治疗方式主要包括手术切除、放疗、化疗、靶向药物治疗等。传统的癌症疗法不具备对肝癌细胞的特异杀伤性，对正常细胞也产生细胞毒性。近年来，随着肿瘤免疫学的不断发展，肿瘤免疫治疗也作为主要治疗手段之一在临床上发挥作用。主要通过调动人体免疫系统，抑制肿瘤的生长及转移过程。另外，纳米医学因其特异性、靶向性等特点在癌症治疗中越来越受到关注。肝癌患者通常使用单一用药模式或利用简单的药物组合治疗模式，往往会因为复杂多变的肿瘤微环境和高度的肿瘤异质性导致药物不能高效精准治疗癌症。对正常细胞产生严重的副作用的同时，使肿瘤局部免疫系统产生抑制，也会进一步降低临床疗效。研究发现，多模式协同治疗利用两种或多种治疗方法协同靶向治疗肿瘤是非常有效的策略，如以下两种方式：
2、1.葡萄糖氧化酶和替拉扎明联合治疗
3、肿瘤局部ph呈弱酸性、含有高水平葡萄糖、谷胱甘肽和乏氧状态等与正常组织不同引。尝试利用这些肿瘤特性可以作为药物设计的新方向。根据warburg效应，肿瘤细胞中超过50％的能量由低效的糖酵解途径产生，这导致它们需要比正常组织细胞摄取更多的葡萄糖引。通过消耗葡萄糖来切断肿瘤的营养供应，作为肿瘤治疗手段之一。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,gox)是一种重要的内源性生物酶，其主要功能是可以氧化肿瘤内部高水平的葡萄糖产生葡萄糖酸。进一步消耗局部
4、2.纳米递送系统
5、随着生物技术以及纳米技术的飞速发展，纳米药物递送系统的构建以及多模式的治疗方式为高效治疗癌症提供了新的方向。发展至今，纳米技术作为一个涉及合成及新材料应用的前沿科技并引发了多领域的变革。对于一些溶解性、分散性较差的药物，可通过纳米颗粒以更高效的方式递送到局部和深处的肿瘤部位，从而减少不必要的副作用[13-15]。众多纳米药物具有良好的生物相容性、非免疫原性、可生物降解等特点。尺寸集中在1～1000nm从而增加细胞摄取率、形貌、表面改性、高渗透性和滞留效果等方面具有优势，这些优异的性质使纳米药物在癌症治疗中处于有利地位。纳米药物具有相对于传统小分子化学药物具备的优势主要包括：(1)较小的毒副作用。纳米载药被动靶向的特点将有助于更多的纳米药物被肿瘤细胞摄取，从而减小对正常组织的毒副作用。(2)生物利用度高。生物相容性良好的高分子纳米材料作为药物载体，将减小体内巨噬细胞以及蛋白质等物质对纳米药物的吞噬和消耗，增大肿瘤细胞对其内化吸收效率。(3)良好的稳定性。将抗肿瘤药物包封于结构稳定的纳米材料将保证在体内循环的稳定性。(4)多功能化的设计。纳米载药体系外部有丰富的官能团，不仅可以修饰上具有对癌症细胞特异性靶向的配体，也可以在纳米载体引入刺激-响应策略，实现药物的智能可控释放。
6、然而，迄今为止这些纳米载药系统仅在临床上对癌症患者的生存结果有一定的改善。此外，系统给药后的纳米药物会被宿主单核巨噬细胞系统(mps)捕获和清除，导致半衰期短和肿瘤蓄积不足。因此，基于细胞膜包裹的仿生纳米载药系统以其优异的生物相容性、体内长循环特性和靶向性吸引了广泛的关注。该仿生纳米载药系统具有典型的核壳结构，细胞来源的膜结构可以保持其原有的生物膜特性，包括红细胞(rbcs)、dc、nk细胞、成纤维细胞、癌细胞等等引。利用具有改善生物相容性、增强药代动力学和特异性靶向能力的仿生纳米载体，可以通过直接传递免疫药物或通过促进某些免疫活性间接促进免疫治疗。不同细胞来源的仿生纳米载体具有其各自的优势和局限性，并且通过促进癌症免疫周期中的不同步骤促进抗肿瘤免疫应答，包括：促进肿瘤抗原释放、增加apc的抗原递呈、增强t细胞的活性和调节肿瘤微环境等。研究人员可以通过改变仿生纳米载体的外膜和内核的组成，提高治疗药物的传递效率并直接或者间接地放大抗肿瘤免疫反应。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种双免疫细胞源性囊泡。首先体外提取人源性单个核细胞(pbmc)，通过诱导培养得到成熟的dc和γδt细胞。经过共挤推的方法合成粒径大小约在120nm的细胞源性囊泡，其次分别将gox和tpz包裹进细胞囊泡后修饰sp94特异性肝癌靶向肽。通过紫外吸收峰(uv)、透射电镜(tme)等验证成功合成了纳米载药囊泡。在细胞实验中，细胞增殖与细胞毒性、活细胞与死细胞染色、凋亡的结果表明，纳米载药囊泡在体外具有很强的抗肿瘤效果，对肿瘤细胞的生长起到了抑制的作用。最后在scid免疫重建小鼠皮下构建hepg2肿瘤模型，通过小动物活体成像和器官代谢验证了lcg在小鼠体内的靶向性；通过观察小鼠体重和小鼠主要脏器：心、肝、脾、肺、肾的he染色证明纳米载药囊泡在体内具有良好的生物安全性；通过测量肿瘤体积、肿瘤体重等证明了纳米载药囊泡在体内具有很强的抗肿瘤效果。
2、本专利技术通过如下技术方案实现：
3、一种双免疫细胞源性囊泡的制备方法，具体步骤如下：
4、步骤1，实验试剂配制的准备：
5、准备好如下实验试剂配制：1×pbs，1×红细胞裂解液，dc专用培养基：1640培养基中含人重组gm-csf(100ng/ml)和il-4(100ng/ml)，完全培养基1640(15％fbs)，1mg/ml gox和tpz；
6、步骤2，人外周血单个核细胞(pbmc)提取：
7、1)使用edta-k2真空采血管，抽取40-50ml健康人外周血，将抽取的外周血用无菌1×pbs溶液进行1：1.5倍比例稀释，充分混匀；
8、2)取10-12支15ml无菌离心管，每支离心管的管底用巴氏吸管加入3-4ml ficoll淋巴细胞分离液；
9、3)在15ml离心管中，每管加入6-8ml稀释混匀后的外周血；
10、4)将离心管转移至离心机中，2500rpm，4℃离心20min；
11、5)取出离心管，此时液体分为四层，从上至下依次为：血浆和血小板层、单个核细胞层、分离液层、多型核白细胞和红细胞层，单个核细胞层呈现为白膜状，用巴氏吸管将白膜层吸出后收集至无菌50ml离心本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双免疫细胞源性囊泡的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.一种双免疫细胞源性囊泡，其特征在于，由权利要求1制备得到。
3.如权利要求2所述的一种双免疫细胞源性囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种双免疫细胞源性囊泡的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.一种双免疫细胞源性囊泡，其特征...
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