【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、多核糖核苷酸可用于多种治疗和工程应用。因此，需要用于分离和纯化多核糖核苷酸的新组合物和方法。
技术实现思路
1、在一方面，本披露的特征在于从多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法。多种多核糖核苷酸包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物，所述环状多核糖核苷酸包含编码多肽的开放阅读框(orf)。所述方法包括(a)提供具有所述多种多核糖核苷酸的样品，其中所述多种多核糖核苷酸的子集包括所述线性多核糖核苷酸；(b)将靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸；以及(c)使所述样品与和所述靶区域杂交的寡核苷酸接触。所述方法进一步包括(d)从所述样品中的多种多核糖核苷酸中分离具有与所述寡核苷酸杂交的所述靶区域的线性多核糖核苷酸。
2、在一些实施例中，寡核苷酸与颗粒(例如，直接地或间接地)缀合。颗粒可以是例如磁珠。在一些实施例中，寡核苷酸与包括多种颗粒的树脂缀合。所述树脂可以包括，例如，交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、琼脂糖、或琼脂糖。在一些实施例中，柱包括树脂。
3、在一些实施例中，将线性多核糖核苷酸分离包括将寡核苷酸固定。
4、在一些实施例中，将线性多核糖核苷酸分离包括将样品中未与寡核苷酸杂交的部分收集。例如，所述样品中未与寡核苷酸杂交的部分可以包括环状多核糖核苷酸。
5、在一些实施例中，来自纯化后环状多核糖核苷酸的orf的表达水平相对于来自纯化前的orf的表达水平增加了至少10％。
6、在另一方面，本披露的特征在于
7、在一些实施例中，样品中未与所述寡核苷酸杂交的部分包括环状多核糖核苷酸。
8、在一些实施例中，所述树脂包括交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、琼脂糖、或琼脂糖。
9、在以上任何方面的一些实施例中，所述方法包括在步骤(a)前从线性前体中将环状多核糖核苷酸环化的步骤。例如，所述线性前体可以包括5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段，并且所述环状多核糖核苷酸是通过所述线性前体的自剪接产生的。5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段可以各自是，例如，i型或ii型自剪接内含子片段。
10、在另一方面，本披露的特征在于从多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法。多种多核糖核苷酸包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物。所述方法包括(a)将线性前体环化以形成所述环状多核糖核苷酸；(b)提供包括多种多核糖核苷酸的样品，其中所述多种多核糖核苷酸的子集包括所述线性多核糖核苷酸；(c)将靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸；以及(d)使所述样品与和所述靶区域杂交的寡核苷酸接触。所述方法进一步包括(e)从所述样品中的多种多核糖核苷酸中分离具有与所述寡核苷酸杂交的所述靶区域的线性多核糖核苷酸。
11、在一些实施例中，将环状多核糖核苷酸环化是通过线性前体的夹板连接产生的。
12、在一些实施例中，所述线性前体包括5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段，并且所述环状多核糖核苷酸是通过所述线性前体的自剪接产生的。
13、在一些实施例中，5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段各自是i型或ii型自剪接内含子片段。
14、在以上任何方面的一些实施例中，所述环状多核糖核苷酸包括orf。orf可以编码，例如，多肽。
15、在以上任何方面的一些实施例中，所述环状多核糖核苷酸包括内部核糖体进入位点(ires)。orf可以与ires可操作地连接。
16、在一些实施例中，所述方法包括将靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸的3’或5’端。例如，所述方法可以包括将靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸的3’端。所述附接步骤可以包括将所述线性多核糖核苷酸的3’端聚腺苷酸化。聚腺苷酸化可以包括提供聚a聚合酶，例如，大肠杆菌(e.coli)聚a聚合酶。在另一实施例中，所述附接步骤包括将靶区域连接至所述线性多核糖核苷酸的3’端。
17、在一些实施例中，步骤(a)的线性多核糖核苷酸包含靶区域(例如，在将步骤(b)中的靶区域附接前)。因此，此类实施例提供了另外的纯化方法，其中靶区域的第一拷贝在步骤(b)前存在于所述线性多核糖核苷酸，并且将靶区域的第二拷贝在步骤(b)期间附接至所述线性多核糖核苷酸。存在于步骤(a)的线性多核糖核苷酸的靶区域与附接至步骤(b)中的线性多核糖核苷酸的靶区域可以是相同的或不同的(例如，在序列和长度上)。在一些实施例中，线性前体包括按5’至3’顺序可操作地连接的靶区域、第一环化元件(例如，第一自剪接内含子片段)、多核糖核苷酸负载物(例如，任选地包括间隔子、ires、和开放阅读框中的一种或多种)、和第二环化元件(例如，第二自剪接内含子片段)。
18、在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不包括聚a序列(例如，至少10个，例如，至少11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、或25个，例如，至少15个、至少20个、至少25个或至少30个连续腺苷核苷酸的聚a序列)。
19、在一些实施例中，靶区域包括聚a序列(例如，至少10个连续腺苷核苷酸的聚a序列)。
20、在一些实施例中，与靶区域结合的寡核苷酸包括聚u或聚dt序列。聚u或聚dt序列可以包括至少10个(例如，至少11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、或25个，例如，至少15个、至少20个、至少25个或至少30个)尿苷或胸苷残基。在一些实施例中，聚dt包括(dt)25。
21、在一些实施例中，寡核苷酸与颗粒缀合。颗粒可以是例如磁珠。在一些实施例中，寡核苷酸与包括多种颗粒的树脂缀合。所述树脂可以包括，例如，交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、琼脂糖、或琼脂糖。在一些实施例中，柱包括树脂。
22、在一些实施例中，将线性多核糖核苷酸分离包括将寡核苷酸固定。
23、在一些实施例中，将线性多核糖核苷酸分离包括将样品中未与寡核苷酸杂交的部分收集。例如，所述样品中未与寡核苷酸杂交的部分可以包括环状多核糖核苷酸。
24、在以上任何方面的一些实施例中，所述方法进一步包括将具有与所述寡核苷酸杂交的所述靶区域的线性多核糖核苷酸洗涤一次或多次。
25、在以上任何方面的一些实施例中，所述方法进一步包括从寡核苷酸中将具有所述靶区域的线性多核糖核苷酸洗脱。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物的多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法，所述环状多核糖核苷酸包含编码多肽的开放阅读框(ORF)，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸与颗粒缀合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述颗粒包含磁珠。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸与包含多种所述颗粒的树脂缀合。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述树脂包含交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、琼脂糖或琼脂糖。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中柱包含所述树脂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将所述线性多核糖核苷酸分离包括将所述寡核苷酸固定。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述线性多核糖核苷酸分离包括将所述样品中未与所述寡核苷酸杂交的部分收集。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述样品中未与所述寡核苷酸杂交的部分包含所述环状多核糖核苷酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中来自纯化后所述环状多
11.一种从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物的多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法，所述方法包括：
12.如权利要求10所述的方法，其中所述样品中未与所述寡核苷酸杂交的部分包含所述环状多核糖核苷酸。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述树脂包含交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、琼脂糖或琼脂糖。
14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(a)前从线性前体中将所述环状多核糖核苷酸环化的步骤。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述线性前体包括5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段，并且其中所述环状多核糖核苷酸是通过所述线性前体的自剪接产生的。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述5’自剪接内含子片段和所述3’自剪接内含子片段各自是I型或II型自剪接内含子片段。
17.一种从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物的多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法，所述方法包括：
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中将所述环状多核糖核苷酸环化是通过所述线性前体的夹板连接产生的。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述线性前体包括5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段，并且其中所述环状多核糖核苷酸是通过所述线性前体的自剪接产生的。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述5’自剪接内含子片段和所述3’自剪接内含子片段各自是I型或II型自剪接内含子片段。
21.如权利要求11-20中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含ORF。
22.如权利要求21中任一项所述的方法，其中所述ORF编码多肽。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述ORF与所述IRES可操作地连接。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸的3’或5’端。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述方法包括将所述靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸的3’端。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述附接步骤包括将所述线性多核糖核苷酸的3’端聚腺苷酸化。
28.如权利要求27所述的方法，其中聚腺苷酸化包括提供聚A聚合酶。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述附接步骤包括将所述靶区域连接至所述线性多核糖核苷酸的3’端。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸不包含聚A序列。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸不包含含有至少10个连续腺苷核苷酸的聚A序列。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述线性多核糖核苷酸包含所述靶区域。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述靶区域包含聚A序列。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述聚A序列包含至少10个连续腺苷核苷酸。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述寡核苷酸包含聚U或聚dT序列。
36.如权利要求...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物的多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法，所述环状多核糖核苷酸包含编码多肽的开放阅读框(orf)，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸与颗粒缀合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述颗粒包含磁珠。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸与包含多种所述颗粒的树脂缀合。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述树脂包含交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、琼脂糖或琼脂糖。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中柱包含所述树脂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将所述线性多核糖核苷酸分离包括将所述寡核苷酸固定。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述线性多核糖核苷酸分离包括将所述样品中未与所述寡核苷酸杂交的部分收集。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述样品中未与所述寡核苷酸杂交的部分包含所述环状多核糖核苷酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中来自纯化后所述环状多核糖核苷酸的所述orf的表达水平相对于来自纯化前的所述orf的表达水平增加了至少10％。
11.一种从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物的多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法，所述方法包括：
12.如权利要求10所述的方法，其中所述样品中未与所述寡核苷酸杂交的部分包含所述环状多核糖核苷酸。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述树脂包含交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、琼脂糖或琼脂糖。
14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(a)前从线性前体中将所述环状多核糖核苷酸环化的步骤。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述线性前体包括5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段，并且其中所述环状多核糖核苷酸是通过所述线性前体的自剪接产生的。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述5’自剪接内含子片段和所述3’自剪接内含子片段各自是i型或ii型自剪接内含子片段。
17.一种从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物的多种多核糖核苷酸中分离线性多核糖核苷酸的方法，所述方法包括：
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中将所述环状多核糖核苷酸环化是通过所述线性前体的夹板连接产生的。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述线性前体包括5’自剪接内含子片段和3’自剪接内含子片段，并且其中所述环状多核糖核苷酸是通过所述线性前体的自剪接产生的。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述5’自剪接内含子片段和所述3’自剪接内含子片段各自是i型或ii型自剪接内含子片段。
21.如权利要求11-20中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含orf。
22.如权利要求21中任一项所述的方法，其中所述orf编码多肽。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(ires)。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述orf与所述ires可操作地连接。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸的3’或5’端。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述方法包括将所述靶区域附接至所述线性多核糖核苷酸的3’端。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述附接步骤包括将所述线性多核糖核苷酸的3’端聚腺苷酸化。
28.如权利要求27所述的方法，其中聚腺苷酸化包括提供聚a聚合酶。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述附接步骤包括将所述靶区域连接至所述线性多核糖核苷酸的3’端。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸不包含聚a序列。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸不包含...
【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山德拉·索菲·德波尔，尼古拉斯·麦卡特尼·普拉吉斯，凯瑟琳·西富恩特斯罗贾斯，白其永，艾丽莎·玛格达莱妮·霍伯特，约书亚·内森·法尔布，瓦迪姆·杜德金，
申请(专利权)人：旗舰创业创新六公司，
类型：发明
国别省市：
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