【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检测领域，特别涉及一种用于面肩肱型肌营养不良症（fshd）快速诊断的引物组、试剂盒及系统。
技术介绍
1、面肩肱型肌营养不良症（facioscapulohumeral muscular dystrophy，fshd）是一种遗传性肌肉疾病，fshd的遗传模式复杂，主要为常染色体显性遗传，大部分患者为家族性遗传，少数为散发性。fshd的发病机制与染色体4q35区域的遗传变异有关，根据遗传变异的不同，fshd分为两种类型：fshd1和fshd2；其中fshd1是由于4号染色体长臂4q的d4z4区域重复单元缺失所致，约占所有fshd病例的约95%；而fshd2由非d4z4区域重复单元缺失的机制所致，但临床症状上fshd1和fshd2难以区分，均会表现出面部、肩带和上臂肌肉萎缩和无力，疾病的进展速度和严重程度在患者之间存在很大差异。而fshd1与fshd2的表观遗传机制一样，均是由于d4z4区域甲基化受阻，使得正常情况下被沉默的基因dux4表观脱抑制导致，fshd1型和fshd2型患者均存在d4z4重复序列cpg岛低甲基化，以及组蛋白抑制性修饰缺失的表观遗传学改变。目前，fshd的诊断依赖临床表现和分子诊断方法的结合，其中分子诊断方法主要包括southern印迹分析、pcr、基因测序和表观遗传分析。
2、现有诊断方法的技术缺陷和不足：
3、目前的分子诊断方法中，southern印迹分析被认为是诊断fshd1的金标准方法，用于检测4q35区域d4z4重复序列的缩短，但该技术检测操作难度大，对仪器、环
4、目前，通过表观遗传分析，检测d4z4区域的甲基化状态有助于实现fshd患者的快速诊断，目前，对于采用pcr结合ngs高通量测序的方法检测染色体4q35 d4z4区域的甲基化水平来进行fshd诊断尚未见报道。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种用于fshd快速诊断的引物组、试剂盒及系统。
2、本专利技术提供一种用于面肩肱型肌营养不良症（facioscapulohumeral musculardystrophy，fshd）快速诊断的分子生物学检测方法。本方法通过对人体4号染色体长臂4q35的d4z4区域进行基因甲基化水平测定，可以准确将fshd阳性患者与正常患者区分开，本方法采用pcr结合ngs高通量测序技术，操作便捷、价格低廉，准确性高，适于推广应用。
3、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
4、本专利技术根据人体基因组4q35区域d4z4重复序列分别设计了4条特异性引物，用于扩增基因组dna甲基化转化后的4qa单倍体型。将4qa基因pcr产物构建成ngs文库并进行ngs测序，分析4qa基因的甲基化水平，从而根据4qa基因表观遗传甲基化比例实现fshd的快速分子诊断。
5、本专利技术第一方面，提供用于fshd快速诊断的引物组，其所述引物组包括如下引物：
6、用于4qa单倍体型的特异性引物，包括：
7、外引物1：5′-ggaagaatatygggttttgttgg-3′（seq id no.1）；
8、外引物2：5′-caacraactcccttacacrtcaa-3′（seq id no.2）；
9、内引物1：5′-tttgggttgtgggagtagtt-3′（seq id no.3）；
10、内引物2：5′-aactccrcrctaacaactaaaa-3′（seq id no.4）。
11、本专利技术第二方面，提供第一方面所述的引物组在制备用于fshd快速诊断的试剂盒中的应用。
12、在一种实施方案中，所述用于fshd快速诊断包括如下步骤：
13、（1）提供待检测基因组dna；
14、（2）将步骤（1）的待检测基因组dna进行甲基化转化，得到转化基因组dna；
15、（3）以步骤（2）的转化基因组dna为模板，用根据第一方面所述的引物组进行巢式pcr扩增；
16、（4）构建ngs文库；
17、（5）进行ngs文库测序并分析4qa基因的q1-四分位数甲基化比例，对结果进行判读。
18、在一个实施方案中，巢式pcr扩增产物在进行下一步反应前，可以进一步纯化；所述纯化采用dna纯化磁珠进行纯化。
19、本专利技术第三方面，提供用于fshd快速诊断的试剂盒，包括上述第一方面所述的引物组。
20、所述试剂盒还包括dna聚合酶、反应缓冲液等。
21、本专利技术第四方面，提供用于fshd快速诊断的装置，其包括：上述第三方面所述的试剂盒；和，用于构建ngs文库的试剂盒。
22、在一种实施方案中，所述用于构建ngs文库的试剂盒包括末端修复酶、接头、连接酶、dna纯化磁珠、文库pcr引物、文库pcr反应缓冲液。
23、本专利技术第五方面，提供用于fshd快速诊断的方法，包括如下步骤：
24、（1）提供待检测基因组dna；
25、（2）将步骤（1）的待检测基因组dna进行甲基化转化，得到转化基因组dna；
26、（3）以步骤（2）的转化基因组dna为模板，用根据第一方面所述的引物组进行巢式pcr扩增；
27、（4）构建ngs文库；
28、（5）进行ngs文库测序并分析4qa基因的q1-四分位数甲基化比例，对结果进行判读。
29、在一种实施方案中，所述基因组dna为全血样本、唾液样本和培养细胞样本中至少一种的基因组dna，优选可采用商业化的dna提取试剂盒。
30、在一种实施方案中，所述甲基化转化为甲基化酶法转化；优选可采用商业化的酶转化试剂盒。
31、在一个实施方案中，巢式pcr扩增产物在进行下一步反应前，可以进一步纯化；所述纯化采用dna纯化磁珠进行纯化。
32、在一种实施方案中，ngs文库的构建可采用商业化的ngs文库制备试剂盒进行构建。
33、在一种实施方案中，所述ngs文库测序为采用二代高通量测序仪进行ngs测序；根据ngs文库类型可以适配不同测序平台，每个样本4qa基因文库的上机测序数据量为0.5g。
34、在一种实施方案中，对结果进行判读，根据4qa基因的q1-四分位数甲基化比例的结果综合判定结果：
35、样本4qa基因的q1-四分位数甲基化比例≤15%为fshd阳性，样本4qa基因的q1-四分位数甲基化比例大于15%为fshd阴性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于FSHD快速诊断的引物组，其特征在于：所述引物组包括如下引物：
2.权利要求1所述的引物组在制备用于FSHD快速诊断的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于FSHD快速诊断包括如下步骤：
4.用于FSHD快速诊断的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA聚合酶、反应缓冲液。
6.用于FSHD快速诊断的装置，其特征在于：包括权利要求4-5任一项所述的试剂盒；和，用于构建NGS文库的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于：所述用于构建NGS文库的试剂盒包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、文库PCR引物、文库PCR反应缓冲液。
8.用于FSHD快速诊断的系统，其特征在于：包括以下模块：
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于：
10.根据权利要求8或9所述的系统，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.用于fshd快速诊断的引物组，其特征在于：所述引物组包括如下引物：
2.权利要求1所述的引物组在制备用于fshd快速诊断的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于fshd快速诊断包括如下步骤：
4.用于fshd快速诊断的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括dna聚合酶、反应缓冲液。
6.用于fs...
【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，陈天达，张海强，
申请(专利权)人：嘉检广州生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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