本发明专利技术涉及用于分析样品的方法，所述方法包括：(a)将包含分析物的样品与至少一种酶一起温育以产生包含所述分析物的片段的消化混合物；(b)将所述消化混合物装载到反相色谱柱上；和(c)对所述消化混合物进行反相色谱法，其中所述至少一种酶经疏水修饰以增加所述至少一种酶的保留时间，使得所述至少一种酶比所述分析物的片段更晚地从所述反相色谱柱洗脱。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及用于使用反相色谱法分析样品的方法。特别地，本公开涉及包括将样品与经疏水修饰的酶一起温育的步骤的方法。
技术介绍
1、肽图分析是用于阐明蛋白的一级氨基酸结构的重要表征技术。特别是在生物制药工业中，肽图分析用于重组蛋白药物，例如单克隆抗体(mab)和抗体-药物偶联物(adc)的身份验证(proof of identity)、一级结构表征和质量保证/质量控制(qa/qc)。
2、使用肽图分析鉴定目的蛋白需要通过蛋白酶消化该蛋白，从而产生包含该蛋白的肽片段的消化混合物。然后通过液相色谱法，通常是反相hplc来分离消化混合物，以产生包含存在于该消化混合物中的每种肽片段的色谱峰的色谱图。该色谱图用于鉴定和/或结构表征目的蛋白。
3、在进行肽图分析期间遇到的一个问题是蛋白酶本身是蛋白。因此，蛋白酶能够自溶，即自我消化。作为结果，通过将蛋白酶与目的蛋白混合而产生的消化混合物通常含有由蛋白酶自溶产生的酶片段。这些酶片段的色谱峰出现在通过hplc分离产生的色谱图中，污染色谱图并使目的蛋白的鉴定和结构表征更加困难。
4、作为对减少在目的蛋白消化期间发生的酶自溶的量的尝试，通常将蛋白酶与目的蛋白以低化学计量比(例如1:100的酶：目的蛋白的比)混合，即目的蛋白过量存在于反应混合物中，使得酶分子遇到目的蛋白分子而不是另一个酶分子的概率增加。使用低化学计量比的酶的问题是在与酶温育期间并非所有目的蛋白分子都将被消化。因此，所得目的蛋白的肽片段的色谱峰具有低强度，这也使得目的蛋白的鉴定和结构表征更具挑战性。
5、用于肽图分析中的最常见的蛋白酶之一是胰蛋白酶，其是在氨基酸赖氨酸和精氨酸的羧基侧上切割肽链的丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶通常在消化期间以1:100至1:20(酶：蛋白)之间的低化学计量比与目的蛋白混合。
6、最近以来，已经开发了针对自溶抗性衍生化的蛋白酶。例如，在其赖氨酸残基上烷基化以防止自溶的胰蛋白酶是市售可得的。这样的抗自溶性蛋白酶使得在肽图分析的蛋白消化步骤中能够使用较高化学计量比的酶，导致目的蛋白的更完全消化和更强的色谱峰。
7、在肽图分析中，仍然存在的一个问题是，通常完整的蛋白酶与目的蛋白的肽片段共洗脱。作为结果，在目的蛋白的色谱图中出现完整的酶的峰。该完整的酶峰可掩蔽由目的蛋白的肽片段产生的峰，特别是强度较低的峰，从而使得目的蛋白的鉴定和表征更具挑战性。当使用抗自溶性酶与目的蛋白的高化学计量比时，该问题加剧：反应混合物中存在的酶的量更大且自溶的量减少，导致完整的酶峰强度更高。
技术实现思路
1、存在对于解决完整的酶峰的色谱图污染问题的肽图分析的改进方法的需要。本公开的专利技术人已经开发了一种这样的方法。然而，本公开的方法不限于肽图分析。在涉及通过酶切割目的分子的其它分析技术中，完整的酶峰对色谱图的污染也是一个问题，例如：涉及目的dna或rna的核酸酶切割的dna或rna定量；和涉及糖苷酶消化的糖肽的结构表征。本公开的方法可以应用于此类分析技术和除蛋白酶之外的酶，以防止完整的酶峰的色谱图污染。
2、根据本专利技术，提供了用于分析样品的方法，该方法包括：
3、(a)将包含分析物的样品与至少一种酶一起温育以产生包含所述分析物的片段的消化混合物；(b)将所述消化混合物装载到反相色谱柱上；和
4、(c)对所述消化混合物进行反相色谱法，
5、其中所述至少一种酶经疏水修饰以增加所述至少一种酶的保留时间，使得所述至少一种酶比所述分析物的片段更晚地从所述反相色谱柱洗脱。由于所述至少一种酶比所述分析物的片段更晚地从所述反相柱洗脱，因此防止了完整的酶峰的色谱图污染。
6、优选地，所述至少一种酶选自蛋白酶、核酸酶或糖苷酶。示例性蛋白酶包括：lys-c；胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；asp-n；arg-c；lys-n；和glu-c。示例性核酸酶包括rnase h和rnase t1。示例性的糖苷酶是n-糖苷酶。
7、有利地，所述至少一种酶是蛋白酶。
8、优选地，所述蛋白酶是经疏水修饰的胰蛋白酶。
9、有利地，所述胰蛋白酶是猪胰蛋白酶(seq id no.1是猪胰蛋白酶)。猪胰蛋白酶比其它形式的胰蛋白酶，例如牛胰蛋白酶(seq id no.2是牛胰蛋白酶)更热稳定。
10、优选地，所述胰蛋白酶是抗自溶的。更优选地，所述胰蛋白酶通过将所述胰蛋白酶中的赖氨酸残基烷基化而衍生化，使得所述胰蛋白酶是抗自溶的。
11、有利地，在该方法的步骤(a)(即，温育步骤)中，所述胰蛋白酶与所述分析物的化学计量比为1:20至2:1，并且步骤(a)包括将样品与所述胰蛋白酶一起温育：在5至9的ph下；在20℃至所述胰蛋白酶的熔解温度(melting temperature)的温度下；并且持续小于或等于4小时的时间段。
12、优选地，在该方法的步骤(a)中，所述胰蛋白酶与所述分析物的化学计量比为1:1。在1:20和2:1之间的化学计量比有助于使得所述分析物的胰蛋白酶消化能够进行至完全。
13、有利地，所述蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，特别是经疏水修饰的ides(seq id no.3是ides)。
14、优选地，所述蛋白酶是抗自溶的。更优选地，在该方法的步骤(a)中，抗自溶性蛋白酶与分析物的化学计量比为1:20至2:1。1:20至2:1的化学计量比有助于使得所述分析物的消化能够进行至完全。
15、有利地，所述酶或每种酶在c-末端经疏水修饰。
16、优选地，所述酶或每种酶在c-末端用序列延伸进行疏水修饰，所述序列延伸包含至少三个疏水性氨基酸残基。
17、有利地，所述酶或每种酶是融合蛋白的部分，其中所述融合蛋白或每种融合蛋白包含来自生物衍生的蛋白结构域的结构域或部分结构域，所述结构域或部分结构域具有大于25的疏水性指数。
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【技术保护点】
1.一种用于分析样品的方法，所述方法包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种酶选自蛋白酶、核酸酶或糖苷酶。
3.权利要求2所述的方法，其中所述至少一种酶是蛋白酶。
4.权利要求3所述的方法，其中所述蛋白酶是经疏水修饰的胰蛋白酶。
5.权利要求4所述的方法，其中所述胰蛋白酶是猪胰蛋白酶。
6.权利要求5所述的方法，其中所述胰蛋白酶是抗自溶的，优选其中所述胰蛋白酶通过所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的烷基化而衍生化。
7.权利要求6所述的方法，并且其中步骤(a)中所述胰蛋白酶与所述分析物的化学计量比为1:20至2:1，并且其中步骤(a)包括将所述样品与所述胰蛋白酶一起温育：在5至9的pH下；在20℃到至多所述胰蛋白酶的熔解温度的温度下；并且持续小于或等于4小时的时间段。
8.权利要求7所述的方法，其中步骤(a)中，所述胰蛋白酶与所述分析物的化学计量比为1:1。
9.权利要求3所述的方法，其中所述蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，优选经疏水修饰的IdeS。
10.权利要求3所述的方法，其中所述蛋白酶是抗自溶的，且优选其中步骤(a)中，所述蛋白酶与所述分析物的化学计量比为1:20至2:1。
11.权利要求1所述的方法，其中所述酶或每种酶在C-末端经疏水修饰。
12.权利要求11所述的方法，其中所述酶或每种酶在C-末端用序列延伸进行疏水修饰，所述序列延伸包含至少三个疏水性氨基酸残基。
13.权利要求1所述的方法，其中所述酶或每种酶是融合蛋白的部分，其中所述融合蛋白或每种融合蛋白进一步包含来自生物衍生的蛋白结构域的结构域或部分结构域，所述结构域或部分结构域具有大于25的疏水性指数。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于分析样品的方法，所述方法包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种酶选自蛋白酶、核酸酶或糖苷酶。
3.权利要求2所述的方法，其中所述至少一种酶是蛋白酶。
4.权利要求3所述的方法，其中所述蛋白酶是经疏水修饰的胰蛋白酶。
5.权利要求4所述的方法，其中所述胰蛋白酶是猪胰蛋白酶。
6.权利要求5所述的方法，其中所述胰蛋白酶是抗自溶的，优选其中所述胰蛋白酶通过所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的烷基化而衍生化。
7.权利要求6所述的方法，并且其中步骤(a)中所述胰蛋白酶与所述分析物的化学计量比为1:20至2:1，并且其中步骤(a)包括将所述样品与所述胰蛋白酶一起温育：在5至9的ph下；在20℃到至多所述胰蛋白酶的熔解温度的温度下；并且持续小于或等于4小时的时间段。
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【专利技术属性】
技术研发人员：M·劳伯，李文静，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：
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