【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、dna测序和dna合成的技术对于现代生物学是至关重要的。dna测序方法允许读取遗传密码，而dna合成方法允许实验室制造基因并产生它们的产物。
2、在它们之间，后者的方法在许多方面显著落后。dna测序的大规模平行方法已经超过了dna合成方法，更显著地是自过去二十年以来由于新一代dna测序技术(ngs技术)的引入的缘故。
3、另一方面，dna合成方法在过去几十年中尚未从根本上改变。从开发诊断试剂盒到生产用于核酸治疗的活性药物成分(api)到构建基于dna的数据存储系统，在生物学的许多分支中需要dna合成。目前核酸合成主要使用1981年在university of colorado由marvincaruthers和同事开发的亚磷酰胺化学在固体支持物上进行。
4、这种亚磷酰胺方法不是环境友好的，因为反应在有机相中发生并产生大量的有机废物。此外，该方法仅可产生达到其约200个核苷酸的限制的短核酸片段。另一方面，大部分基因构建体需要在2,000至3,000个核苷酸的范围内。对于较长长度的寡核苷酸，迄今为止仅有的一种可行方法是pcr反应，其使用具有重叠区段的较短合成核酸用于缝合在一起并逐步扩增以产生较长的dna分子片段。通常，这样的方法是耗时的并且成本过高。
5、为了克服这一限制，在开发用于dna合成的替代性方法中已经付出了相当大的努力。主要原因是实现dna分子的更长链的快速、准确和有效合成，还能够同时产生许多dna序列，实现环境友好和总成本降低。
6、在这方面已引起
7、这在很大程度上与最有效的dna测序方法(通常称为边合成边测序(sbs))如何起作用类似。在两种情况下，核苷酸的3’-oh基团必须用较小的官能团封端以用于酶促掺入。且更重要的是，该封端基团必须在与脆弱的dna分子相合的条件下通过化学处理除去。因此，经证明在边合成边测序中可用的可逆核苷酸终止子也可能满足酶促dna合成的两个基本要求，即通过单个碱基终止和在与dna相容的条件下的可切割性。
8、已知3’-oh保护的核苷酸，特别是3’-o-ch2ssme因其较小的尺寸而被聚合酶接受以通过单个碱基掺入终止dna合成。在后续步骤中，可以使用无害化学品，例如用硫醇和膦将它除去。此类技术公开于us10301346、us10273539和us10336785中，其在测序过程中与模板寡核苷酸一起使用。
9、许多核苷酸类别是酶促掺入dna分子的生长链的良好底物，但其不能在无害的、与dna相容的条件下切割，这限制了它们在dna测序中的用途。这样的核苷酸在直接dna和rna合成中，即不使用模板链的情况下不能成为选择，因为在dna和rna友好条件下的可切割性是dna测序和合成方法二者中的基本方面。
10、因此，本专利技术的目的是提供用于通过酶促反应直接合成dna和rna的封闭核苷酸。
技术实现思路
1、发现3’-oh保护的核苷酸，特别是从边合成边测序方法中已知的3’-o-ch2ssme可用于dna和rna合成的直接、无模板的酶促合成。
2、因此，本专利技术的目的是用于合成dna或rna链的方法，该方法包括以下步骤：
3、a)提供能够与核苷酸结合的引物
4、b)提供根据通式(i)的第一核苷酸
5、
6、其中
7、b＝天然或非天然的核碱基
8、r＝-me、-et、-pr、-ipr、-ibu、ch2ch2nh2、ch2ch2cn
9、r1，r2＝h、d、-me、-et、-pr、-ipr、-ibu、chf2 ch2ch2f
10、c)提供末端转移酶，从而将所述第一核苷酸连接至所述引物
11、d)将保护基团ss-r从所述第一核苷酸上切割并除去
12、e)通过提供另外的根据通式(i)的核苷酸重复步骤b)至d)，从而获得dna或rna链。
13、本专利技术的方法不涉及获得dna或rna链的测序信息，而涉及用于合成dna或rna链的方法。因此，在一个优选的实施方案中，在步骤b)和e)中提供的根据通式(i)的第一核苷酸和另外的核苷酸不包含可检测标记。术语“可检测标记”涵盖了边合成边测序技术中使用的所有标记，如染料，尤其是荧光染料、质量标签和放射性标签。
14、理论上，步骤b)至d)(即步骤e))可根据需要重复多次，以获得具有所需长度的dna或rna链。然而，在实践中，步骤b)至d)(即步骤e))通常重复10至1000次。
15、具有3’-och2ssme基团的核苷酸通过单个碱基延伸终止dna合成，并且当用tcep或硫醇化合物处理时，它可以按需进一步延伸。tcep和硫醇化合物是温和的，并且在与dna相容的条件下工作良好，这也使得它们是dna和rna合成的优异候选。
16、利用本专利技术的方法，可以使用3’-o-(ch2ssr)保护的可逆核苷酸终止子酶促合成核酸。受保护的核苷酸的核苷酸碱基可以由天然或非天然(例如7-脱氮g和7-脱氮a)或其混合物组成。核苷酸的碱基可以用接头修饰，所述接头携带羧酸(-co2h)、胺(-nh2)、硫醇(-sh)、羟甲基(-ch2oh)、炔丙胺、炔基等，用于随后的修饰和标记。此类核苷酸底物可以掺入单链、非模板核酸中或掺入模板dna杂交体中。并且在随后的步骤中，3’-o-ch2ssr保护基团可以通过酶促核酸合成的化学处理先决条件被切割掉。通过以预先确定的方式加入核苷酸并在每个步骤后进行切割反应，可以从短的种子dna链(seeding dna strand)开始在溶液中或固体表面上合成较长的dna链。
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1.一种用于合成DNA或RNA链的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物是DNA或RNA链。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述引物是结合到固体表面的DNA或RNA链。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于X选自氢、羟基、卤素、-OMe、-OEt、-OCH2SSMe、-OCH2CH2NH2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于通过提供切割试剂来进行步骤c)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述切割试剂选自硫醇、二硫苏糖醇(DTT)、二巯基丙磺酸(DMPS)、膦、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(3-羟丙基)膦(THPP)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于通过提供二价离子来进行步骤c)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于在7–10的pH范围内进行步骤c)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于所述在步骤b)和e)中提供的根据通式(I
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于合成dna或rna链的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物是dna或rna链。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述引物是结合到固体表面的dna或rna链。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于x选自氢、羟基、卤素、-ome、-oet、-och2ssme、-och2ch2nh2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于通过提供切割试剂来进行步骤c)。
6.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·M·马尔马，S·索利曼，管晓培，M·佩博斯特，R·皮纳德，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：
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