【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体地涉及工程化cas9蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)是一种自然界广泛存在的原核生物防御系统，用于抵御入侵的噬菌体和外源基因物质。该防御系统通过一条单链向导rna(guide rna，grna)来识别特定的dna序列，并引导具有核酸内切酶活性的crispr相关(crispr associated，cas)蛋白剪切dna双链。crispr/cas系统存在于多种细菌和古细菌中，其包括3种主要类型(i型、ii型和iii型)和12种亚型。与i型和iii型相比，ii型crispr/cas系统可依靠单个cas蛋白来精确靶向特定的dna序列，因此它是目前应用较为广泛的基因编辑系统。crispr/cas9系统是ii型crispr/cas系统的成员之一，由于其操作简单且编辑效率高，因此该系统是目前全球范围内应用最为广泛的基因编辑系统，并为科学研究带来了许多新的可能性，尤其为疾病治疗和农作物改良等领域提供了强有力的技术支持。
2、crispr/cas9系统由具有dna内切酶活性的cas9蛋白和一个由crispr rna(crrna)和反式激活crrna(trans-activating crrna，tracrrna)融合的向导rna(guide rna，grna)组成。在基因编辑过程中，grna将cas9蛋白引导至相邻的原间隔序列临近基序(proto
3、作为原核生物抵抗噬菌体和外源基因物质的适应性免疫系统，crispr/cas9系统也被广泛用于靶向清除各种病毒感染，包括人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，hiv)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)、eb病毒(epstein-barr virus，ebv)、巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)、人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus，hpv)和乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)等。与人类基因组不同，病毒基因组可在人类细胞中不断扩增。以hbv为例，完整的hbv病毒颗粒含有长度约为3.2kb的部分双链松弛环状dna(relaxed circular dna，rcdna)，其感染肝细胞后，部分rcdna进入细胞核并转化为子代rcdna复制的模板-共价闭合环状dna(covalently closed circular dna，cccdna)。反过来，新产生的子代rcdna也可以进入细胞核补充cccdna池，进而使cccdna在肝细胞内不断更新和扩增并维持一定的水平。hbv感染对全球的经济和卫生系统造成了沉重负担，并严重危害着人们的身体健康。目前，临床上针对hbv的抗病毒药物主要为长效干扰素和核苷(酸)类药物。虽然两种药物均可有效抑制hbv复制并延缓疾病进程，但临床治愈率较低。究其原因，主要是由于当前药物均不可直接作用于hbv cccdna。尽管本专利技术人和其他研究团队已报道crispr/cas9系统可通过破坏hbv基因组高效抑制hbv复制，但为了清除不断扩增的cccdna，仍需更加稳定和高效的crispr/cas9系统。
4、由于cas9/grna核糖核蛋白(rnp)复合物可快速高效地实现基因编辑并具有较高的安全性，因此其应用越来越广泛。在cas9/grnarnp复合物中，尽管可通过多种化学修饰手段提高grna的稳定性，但要想更加高效和持久地破坏不断扩增的病毒基因组仍需更加稳定的cas9蛋白。然而，cas9蛋白在细胞内的降解机制尚未阐明。因此，揭示cas9蛋白在细胞内的降解机制，并在此基础上构建高度稳定的cas9蛋白将有助于靶向清除病毒感染并可通过降低cas9蛋白在cas9/grna rnp复合物中的用量有效降低基因编辑的成本。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的至少部分问题，本专利技术构建了一种高度稳定的工程化cas9蛋白，进而为crispr/cas9系统在靶向清除病毒感染提供了新工具和新策略，并可通过减少cas9蛋白的用量并有效降低基因编辑的成本，进而有助于crispr/cas9系统的进一步推广应用。具体地，本专利技术包括以下内容。
2、本专利技术的第一方面，提供工程化cas9蛋白在制备治疗或改善病毒感染的药物中的应用，其中，所述工程化cas9蛋白含有第669-673和/或第892-896位的五肽基序中的至少一个氨基酸突变。
3、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的应用，其中，所述突变包括第672位的非k氨基酸、第673位的非q氨基酸、第892位的非q氨基酸和第893位的非r氨基酸中的至少一种。
4、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的应用，其中，所述非k氨基酸选自a、n、v、g、l、q、f、w、y、d、s、e、m、t、c、p、h和i中的至少一种。
5、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的应用，其中，所述非q氨基酸选自a、n、v、g、l、f、w、y、d、s、e、m、t、c、p、h、r、i和k中的至少一种。
6、在某些实施方案中，根据本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.工程化Cas9蛋白在制备治疗或改善病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述工程化Cas9蛋白含有第669-673和/或第892-896位的五肽基序中的至少一个氨基酸突变。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述突变包括第672位的非K氨基酸、第673位的非Q氨基酸、第892位的非Q氨基酸和第893位的非R氨基酸中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非K氨基酸选自A、N、V、G、L、Q、F、W、Y、D、S、E、M、T、C、P、H和I中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非Q氨基酸选自A、N、V、G、L、F、W、Y、D、S、E、M、T、C、P、H、R、I和K中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非R氨基酸选自A、N、V、G、L、Q、F、W、Y、D、S、E、M、T、C、P、H和I中的至少一种。
6.工程化Cas9蛋白和至少一种向导RNA的组合在制备治疗或改善病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述工程化Cas9蛋白为权利要求1-5任一项中的工程
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒包括乙型肝炎病毒。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗或改善包括以下中的至少一种：
9.工程化Cas9蛋白包含其的基因编辑工具的制备方法，其特征在于，包括在野生型Cas9蛋白第669-673和/或第892-896位的五肽基序中引入至少一个氨基酸的突变的步骤；
10.工程化Cas9蛋白或包含其的基因编辑工具联合其它药物在制备联合给药的药物中的应用，其特征在于，所述工程化Cas9蛋白为权利要求1-8任一项中的工程化Cas9蛋白；
...【技术特征摘要】
1.工程化cas9蛋白在制备治疗或改善病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述工程化cas9蛋白含有第669-673和/或第892-896位的五肽基序中的至少一个氨基酸突变。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述突变包括第672位的非k氨基酸、第673位的非q氨基酸、第892位的非q氨基酸和第893位的非r氨基酸中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非k氨基酸选自a、n、v、g、l、q、f、w、y、d、s、e、m、t、c、p、h和i中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非q氨基酸选自a、n、v、g、l、f、w、y、d、s、e、m、t、c、p、h、r、i和k中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非r氨基酸选自a、n、v、g、l、q、f、w、y、d、s、e、m、t、c、p、...
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