【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型适配体核酸分子，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的rna、dna或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本专利技术的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。
技术介绍
1、生物大分子标记技术是生物分子成像的关键，它对于理解各种细胞生命过程至关重要。在科学历史上，科学家们利用荧光蛋白“点亮”细胞内蛋白质,实现了生命动态过程中蛋白质分子的可视化。荧光蛋白成像技术是当代生物科学研究中最重要的工具之一，2008年诺贝尔化学奖就授予给三位为荧光蛋白做出重要贡献的科学家。在活细胞中，rna也具有独特的结构、种类繁多的生物学功能以及复杂的时间空间分布。不同种类的rna及其修饰形式的鉴定、功能与调控研究现已经成为了国际前沿。
2、rna荧光原位杂交技术是长期以来被广泛用于来研究rna在细胞内水平与分布的方法，它是通过分子杂交对特异rna分子进行荧光标记，进而进行成像的技术。然而其操作较复杂且含有洗脱步骤，只能用于固定化细胞即死细胞的研究，不能用于实时监测活细胞中rna的动态变化过程。
3、分子信标技术是最早发展起来的活细胞rna成像技术。它是一种在5’和3’末端自身形成发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，当其与靶标rna结合后，标记在一端的猝灭基团对荧光基团的猝灭作用消除，荧光基团产生荧光，或者两端荧光基团的fret消失。然而分子信标存在着荧光信号偏低、进细胞困难、易降解、较严重的细胞核内非特异性聚集、易受rna二级结构的影响且需要对每条rna专
4、目前用于活细胞rna成像的方法主要是利用mcp-fps系统，mcp-fps可以特异性识别结合融合了多拷贝ms2序列的mrna分子，通过检测荧光蛋白的信号实时监测mrna的合成及分布(ozawa et al.nature methods.2007.4:413-419)。但由于未结合mrna分子的mcp-fps会产生很高的本底荧光，使得该方法的信噪比很低。随后，科学家们将mcp-fps融合蛋白加上核定位信号，使得没有与mrna分子结合的gfp-ms2定位细胞核中，一定程度降低了细胞胞浆中的非特异荧光，提高了检测的信噪比。
5、自然界存在天然的荧光蛋白，但尚未有天然的荧光rna被报道。荧光rna的概念最初是由荧光蛋白的诺贝尔化学奖获得者之一钱永健(roger tsien)教授于2003年提出，认为可以利用rna适配体特异性识别结合并激活染料分子，进而实现对rna的可视化。基于这样的原理，他的课题组筛选获得了可以结合并激活三苯甲烷染料孔雀石绿(mg)染料分子，荧光增强倍数可达2360倍。可惜的是，由于mg本身是生物染色剂，因而不能用于活细胞rna标记。受这一发现的鼓舞和启发，在过去的十多年里，科学家们还发展了其他的rna适配体-荧光团复合物，包括基于hoechst衍生物、花菁类染料、荧光团-猝灭基团(fq)以及荧光蛋白生色团衍生物的荧光rna。相比较其他rna成像技术，人们只需要将rna适配体编码序列与靶标rna编码序列融合表达，加入染料分子即可对rna标记成像，无需引入其他核酸活蛋白质分子，因此是最直接的一种rna成像方法，也是最有希望成为理想的活细胞rna标记与成像技术。
6、2011年s.jaffrey课题组利用selex方法，以绿色荧光蛋白生色团hbi的衍生物dfhbi(3,5-difluoro-4-hydroxybenzyli-dene imidazolinone)为筛选靶标，获得了称为“spinach”的核酸适配体。spinach与dfhbi结合后，可显著增强dfhbi的荧光信号。利用spinach-dfhbi复合物，他们首次实现了在哺乳动物细胞内对靶标rna的示踪(paige etal.science.2011.333:642-646)。该课题组将“spinach”中的一个茎环结构换成可以特异性结合细胞代谢物的核酸适配体，开发了基于spinach-dfhbi复合物的可以检测细胞代谢物的工具(paige et al.science.2012.335:1194)。到目前为止，该方法已被成功用于细菌、酵母和哺乳动物细胞中的rna动态变化的监测及分析。之后，该课题组对核酸适配体分子及荧光团分别做了优化，获得了spinach2-dfhbi-1t，新复合物性质得到进一步提升。2014年，该课题组将selex与流式细胞分析术结合并筛选获得了broccoli(filonov etal.journal of the american chemical society.2014.136:16299-16308)，broccoli-dfhbi-1t相比于之前的spinach-dfhbi和spinach2-dfhbi-1t，在荧光强度、稳定性等各方面均有显著的提升。但是broccoli-dfhbi-1t依旧存在着镁离子依赖严重、光稳定性差的问题。2020年，该课题组对dfhbi-1t进一步优化，得到新的荧光团bi，最终获得新的复合物broccoli-bi(li et al.angewandte chemie international edition inenglish.2020.59:4511-4518)。2017年，该课题组还开发了corn-dfho复合物用于检测哺乳动物细胞rna聚合酶iii启动子的活性检测(song et al.nature chemicalbiology.2017.13:1187-1194)。
7、2019年，来自中国的杨弋教授与朱麟勇教授构成的联合攻关团队在荧光rna领域取得了突破性进展。他们基于全新的分子设计理念设计合成了全新的荧光团分子hbc，并筛选得到了与之高度亲和的核酸适配体pepper。同时，在hbc基础上进行化学修饰，得到一系列衍生物，与pepper结合后的复合物光谱涵盖青色、绿色、橙色和红色。pepper-hbc620复合物可以发出明亮的红色荧光，且有着较好的光稳定性，可以实现sim超分辨成像。
8、综上所述，目前使用的rna标记技术都存在各自的缺点。mcp-fps标记技术存在着非特异性结合造成的本底荧光强，信噪比低。基于适配体-荧光团-猝灭剂构成的复合物的rna标记技术目前只在细菌中实现对rna的标记，还没有实现在哺乳动物细胞中标记rna。基于单荧光团-核酸适配体的rna标记技术看起来是非常完美的rna标记技术，然而受限于目前可供选择的可以生物正交的荧光rna种类少，且大多数复合物位于绿色波段，存在较强镁离子依赖性，光稳定差等，因而该技术也没有被广泛使用。因此，科研界和产业界一直都需要更加有效的荧光团-核酸适配体复合物，能克服此前荧光团-核酸适配体复合物的缺点，用于活细胞中的rna或dna的实时标记。
9、专利技术的简述
10、本专利技术提供了一种核酸适配体分子，编码该核酸适配体分子的dna分子，一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，以及该复合物的用途。
11、本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种荧光团分子，其特征在于，具有下述式(I)所述的结构：
2.根据权利要求1所述的荧光团分子，其特征在于，式(I-1)所述电子受体部分为选自下式(I-2-15)、(I-2-16)、(I-2-17)中的一种：
3.根据权利要求1所述的荧光团分子，其特征在于，选自下式化合物：
【技术特征摘要】
1.一种荧光团分子，其特征在于，具有下述式(i)所述的结构：
2.根据权利要求1所述的荧光团分子，其特征在于，式(i-1)所述电子受体部分...
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