【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及一种生产(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的方法。
技术介绍
1、l-高丝氨酸(l-homoserine)又名(s)-2-氨基-4-羟基丁酸，是一种生物合成必需氨基酸l-甲硫氨酸及l-苏氨酸的重要中间体，同时也是合成多种c4化合物和l-草铵膦的平台化合物，广泛应用于医药，农业，化妆品及香水行业。
2、(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的制备方法主要有化学合成法及生物转化法。化学合成法存在反应条件苛刻、反应步骤长、生产效率低及安全性低等问题，逐渐被取代。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。
3、目前，国内外学者报道了一些(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的生物法制备路线，例如ning li等通过改造谷氨酸棒状杆菌的代谢路径，构建(s)-2-氨基-4-羟基丁酸生产菌，经96h发酵，(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的产量达63.5g/l，时空产率为0.66g/l/h。
4、以上报道的(s)-2-氨基-4-羟基丁酸生物合成路线具有时空产率低、生产效率低和底物成本高等缺点，因此，亟需提供一条效率高、成本低的(s)-2-氨基-4-羟基丁酸制备方法。
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种生产(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的方法，该方法是通过构建一种能够表达l-氨基酸脱氨酶、4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的基因
2、本专利技术为了改善(s)-2-氨基-4-羟基丁酸在现有技术中存在的时空产量低、生产效率低、底物成本高等缺陷，提供了新的合成路线。
3、对于(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的合成，本专利技术通过l-氨基酸脱氨酶(laad)将l-丙氨酸转化为丙酮酸，通过4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶(hoa)将丙酮酸及甲醛转化为4-羟基-2-氧代丁酸，通过转氨酶(ta)将4-羟基-2-氧代丁酸转化为l-高丝氨酸，以l-谷氨酸作为氨基供体被转化为α-酮戊二酸，通过谷氨酸脱氢酶(gludh)将α-酮戊二酸转化为l-谷氨酸，构建l-谷氨酸循环再生体系，反应过程中所需辅酶nadph由菌体代谢葡萄糖来提供。反应原理如图1所示。
4、基于上述合成路线，本专利技术提供了一种生产(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的基因工程菌，该基因工程菌中包含编码laad、hoa、ta和gludh的基因。
5、根据上述反应原理，专利技术人将编码laad、hoa、ta和gludh的基因导入宿主菌中，获得一种基因工程菌，以该基因工程菌作为生物催化剂，可将底物l-丙氨酸、甲醛及氨转化为(s)-2-氨基-4-羟基丁酸。
6、在一些实施方式中，laad包括bplaad及pvlaad，bplaad的氨基酸序列如seq idno.1所示；pvlaad的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7、在本专利技术中，bplaad来源于bordetella pertussis，genbank编号cae41061.1；pvlaad来源于proteus vulgaris，genbank编号baa90864.1。专利技术人在获得bplaad和pvlaad的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
8、在一些实施方式中，bplaad的核苷酸序列如seq id no.9所示；pvlaad的核苷酸序列如seq id no.10所示。
9、在一些实施方式中，hoa包括pshoa和echoa；pshoa的氨基酸序列如seq id no.3所示；echoa的氨基酸序列如seq id no.4所示。
10、在本专利技术中，pshoa来源于pseudomonas sp，genbank编号caa43227.1；echoa来源于escherichia coli，genbank编号baa13057.1。专利技术人在获得pshoa和echoa的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
11、在一些实施方式中，pshoa的核苷酸序列如seq id no.11所示；所述echoa的核苷酸序列如seq id no.12所示。
12、在一些实施方式中，转氨酶包括bsta和ssta；bsta的氨基酸序列如seq id no.5所示；ssta的氨基酸序列如seq id no.6所示。
13、在本专利技术中，bsta来源于bacillus subtilis，genbank编号qhf59561.1，genbank编号spc35538.1；ssta来源于streptococcus salivarius，genbank编号kxu58123.1。专利技术人在获得bsta和ssta的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
14、在一些实施方式中，bsta的核苷酸序列如seq id no.13所示；ssta的核苷酸序列如seq id no.14所示。
15、在一些实施方式中，谷氨酸脱氢酶包括ssgludh和ppgludh；ssgludh的氨基酸序列如seq id no.7所示；ppgludh的氨基酸序列如seq id no.8所示。
16、在本专利技术中，ssgludh来源于streptomyces sp.，genbank编号wp_031092864.1；ppgludh来源于palaeococcus pacificus，genbank编号wp_048165779.1。专利技术人在获得ssgludh和ppgludh的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
17、在一些实施方式中，ssgludh的核苷酸序列如seq id no.15所示；ppgludh的核苷酸序列如seq id no.16所示。
18、在一些实施例中，上述基因工程菌的构建方法，包括：将laad、hoa、ta和gludh的基因插入到表达载体中获得重组载体，然后将重组载体导入宿主菌中，即获得基因工程菌。
19、在一些实施方式中，表达载体包括pcdfduet-1和pacycduet-1质粒。
20、在一些实施方式中，上述基因工程菌的宿主为大肠杆菌。
21、在一些实施方式中，上述大肠杆菌选自escherichia coli bl21(de3)、escherichia coli dh5α和escherichia coli xl-blue中的任意一种。
22、在本专利技术中，在上述laad、hoa、ta和gludh中各选一个酶，进行四酶组合共表达，对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，可以是其中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产(S)-2-氨基-4-羟基丁酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基因组中包含编码L-氨基酸脱氨酶、4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶包括BpLAAD和PvLAAD；所述BpLAAD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PvLAAD的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶包括PsHOA和EcHOA；所述PsHOA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述EcHOA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述转氨酶包括BsTA和SsTA；所述BsTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SsTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶包括SsGluDH和PpGluDH；所述SsGluDH的氨基酸序列如SEQ I
6.如权利要求1-5任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法包括：将L-氨基酸脱氨酶、4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的基因插入到表达载体中获得重组载体，然后将所述重组载体导入宿主菌中，即获得所述基因工程菌；
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过将BpLAAD、PsHOA、BsTA和PpGluDH插入到表达载体中获得重组载体，然后将所述重组载体导入宿主菌中，培育筛选获得生产(S)-2-氨基-4-羟基丁酸的基因工程菌；
8.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1-7任一项所述的基因工程菌。
9.一种生产(S)-2-氨基-4-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括将权利要求1-7任一项所述的基因工程菌加入到含有L-丙氨酸、甲醛和氨的溶液中进行全细胞转化，获得所述(S)-2-氨基-4-羟基丁酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：L-丙氨酸1-60g/L，甲醛1-20g/L，醋酸铵5-60g/L，L-谷氨酸1-5g/L，葡萄糖10-100g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，工程菌体量1-20g/L；
...【技术特征摘要】
1.一种生产(s)-2-氨基-4-羟基丁酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基因组中包含编码l-氨基酸脱氨酶、4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述l-氨基酸脱氨酶包括bplaad和pvlaad；所述bplaad的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述pvlaad的氨基酸序列如seq idno.2所示；
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶包括pshoa和echoa；所述pshoa的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述echoa的氨基酸序列如seq id no.4所示；
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述转氨酶包括bsta和ssta；所述bsta的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述ssta的氨基酸序列如seq id no.6所示；
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶包括ssgludh和ppgludh；所述ssgludh的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述ppgludh的氨基酸序列如seqid no.8所示；
【专利技术属性】
技术研发人员：陶福平，叶芳胜，秦勇，杨波，
申请(专利权)人：江西唯铂莱生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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