【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞、细胞相关物质检测领域，具体涉及一种用于细胞外囊泡的探针及其制备方法和应用。
技术介绍
1、小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sev)是多种哺乳动物细胞自发或在一定条件下释放出的一种由脂质双分子层包裹形成的闭合球形囊泡。sev富含多种蛋白质、核酸、脂类等生物活性物质，在多种生理病理发展过程中扮演着重要的作用；sev可以作为标记物诊断疾病、监测疾病进展、评估预后，也可以作为药物或药物载体，在维持生理状态和治疗疾病中发挥着重要作用。因此，对分离的sev进行体外标记或活体示踪对于其功能研究具有重要意义。
2、但现有的用于标记小细胞外囊泡的探针与小细胞外囊泡标记时间长，标记效率低，影响检测结果。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种用于细胞外囊泡的探针及其制备方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于细胞外囊泡的探针，所述用于细胞外囊泡的探针的化学结构式如式ⅰ所示：
3、
4、上述用于细胞外囊泡的探针与小细胞外囊泡具有更优异的融合性能，与小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sev)在室温(20～30℃)培养基中混合孵育15分钟至30分钟即可高效实现对小细胞外囊泡的标记，而且具有特异性荧光基团，在487nm左右激发波长光下，发射波长在504nm左右，标记后，可以实现荧光检测追踪，对分离的
5、本专利技术还提供上述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
6、(1)将如式ⅱ所示的化合物与n-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比1：(2～3)在二氯甲烷中混合后；
7、
8、(2)加入二甲基氨基吡啶(dmap)和n，n′-二环己基碳二亚胺(dcc)于20～30℃搅拌反应1.5～4小时；
9、(3)将步骤(2)反应后的混合溶液上聚酰胺柱后用二氯甲烷冲洗；
10、(4)用乙醇的体积为40％～60％水-乙醇混合溶剂洗脱获得馏分a；
11、(5)用氯仿-甲醇混合溶剂洗脱获得馏分b；氯仿的体积分数为40％～60％；
12、(6)将馏分b去除溶剂结晶。
13、上述制备方法通过酯化反应后，利用聚酰胺柱洗脱，纯化，实现将如式ⅰ所示用于细胞外囊泡的探针纯化分离，进而用作探针。
14、优选地，去除溶剂的方式包括真空蒸发、负压蒸发，温度不超过30℃。
15、优选的，步骤(1)中，如式ⅱ所示的化合物与n-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比1：(2.2～2.5)混合。
16、优选的，二甲基氨基吡啶的用量占步骤(2)混合液质量的4％～7％，n，n′-二环己基碳二亚胺与二甲基氨基吡啶的摩尔比为1：(0.95～1.05)。
17、本专利技术还提供一种用于细胞外囊泡的检测方法，所述方法包括以下步骤：
18、(a)将式ⅰ所述用于细胞外囊泡的探针的溶液与细胞外囊泡溶液混合，ph为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液定容，充分混匀于避光条件下25～30℃孵育15分钟至30分钟；
19、(b)将步骤(a)中的液体转入无菌离心管中，100000～130000倍重力离心30～50分钟去除上层清液；
20、(c)将步骤(b)得到的沉淀物在pbs溶液中重悬，在300nm～700nm波长下测定荧光强度。
21、上述用于细胞外囊泡的探针与小细胞外囊泡具有更优异的融合性能，与小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sev)在室温(20～30℃)培养基中混合孵育15分钟至30分钟即可高效实现对小细胞外囊泡的标记，而且具有特异性荧光基团，在486nm左右激发波长光下，发射波长在504nm左右，标记后，可以实现荧光检测追踪。检测用于标记的时间短，提高检测效率。
22、优选地，所述细胞外囊泡溶液的溶剂为dmem/f12完全培养基，细胞外囊泡的探针溶液的溶剂为ph为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液；用于细胞外囊泡的探针与细胞外囊泡的用量比例为2.5mol～5mol用于细胞外囊泡的探针比100g细胞外囊泡。
23、优选地，所述方法包括以下步骤：
24、(a)将如式ⅰ所述用于细胞外囊泡的探针的溶液100～200μl与细胞外囊泡溶液100～200μl混合，细胞外囊泡的探针的用量为2.5μmol～5μmol，细胞外囊泡的用量为80～120μg，ph为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液定容至0.8～1.2ml，充分混匀于避光条件下25～30℃孵育15分钟至30分钟；
25、(b)将步骤(a)中的液体转入无菌离心管中，100000～130000倍重力离心30～50分钟去除上层清液；
26、(c)将步骤(b)得到的沉淀物在0.8～1.2mlpbs溶液中重悬，在300nm～700nm波长下测定荧光强度。
27、本专利技术还提供一种用于细胞外囊泡的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括0.8～2mmol如式ⅰ所述用于细胞外囊泡的探针，100～500mmol的ph7.0～7.4的磷酸盐缓冲盐固体制剂或缓存液，所述磷酸盐固体制剂由磷酸一氢盐和磷酸二氢盐配置。
28、优选地，所述检测试剂盒包括100～500mmol的ph7.0～7.4的磷酸盐缓存液且不包括磷酸盐缓冲盐固体制剂，磷酸盐缓存液的浓度为15～30mmol/l。
29、优选地，所述如式ⅰ所述用于细胞外囊泡的探针以磷酸盐缓存液为溶剂配置为100～500mmol/ml的母液。
30、优选地，试剂盒还包括说明书，说明书记载如式ⅰ所述用于细胞外囊泡的探针的化学结构。
31、优选地，说明书还记载上述任一用于细胞外囊泡的检测方法。
32、优选地，说明书还记载如式ⅰ所述用于细胞外囊泡的探针的激发波谱和发射波谱。
33、本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种用于细胞外囊泡的探针及其制备方法和应用，本专利技术用于细胞外囊泡的探针与小细胞外囊泡具有更优异的融合性能，与小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sev)在室温(20～30℃)培养基中混合孵育15分钟至30分钟即可高效实现对小细胞外囊泡的标记，而且具有特异性荧光基团，在486nm左右激发波长光下，发射波长在504nm左右，标记后，可以实现荧光检测追踪，对分离的sev进行体外标记或活体示踪具有重要意义。由于与小细胞外囊泡(small extracellularvesicles，sev)在室温(20～30℃)培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于细胞外囊泡的探针，其特征在于，所述用于细胞外囊泡的探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
2.如权利要求1所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，去除溶剂的方式包括真空蒸发、负压蒸发，温度不超过30℃。
4.根据权利要求2所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，如式Ⅱ所示的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比1：(2.2～2.5)混合。
5.根据权利要求2所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，二甲基氨基吡啶的用量占步骤(2)混合液质量的4％～7％，N，N′-二环己基碳二亚胺与二甲基氨基吡啶的摩尔比为1：(0.95～1.05)。
6.一种用于细胞外囊泡的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述用于细胞外囊泡的检测方法，其特征在于，所述细胞外囊泡溶液的溶剂为DMEM/F12完全培养基，细胞外囊泡的探针溶液的溶剂为pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液；用于
8.根据权利要求6所述用于细胞外囊泡的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
9.一种用于细胞外囊泡的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括0.8～2mmol如权利要求1所述用于细胞外囊泡的探针，100～500mmol的pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲盐固体制剂或缓存液，所述磷酸盐固体制剂由磷酸一氢盐和磷酸二氢盐配置。
10.根据权利要求9所述用于细胞外囊泡的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括100～500mmol的pH7.0～7.4的磷酸盐缓存液且不包括磷酸盐缓冲盐固体制剂，磷酸盐缓存液的浓度为15～30mmol/L；所述如权利要求1所述用于细胞外囊泡的探针以磷酸盐缓存液为溶剂配置为100～500mmol/mL的母液；试剂盒还包括说明书，说明书记载权利要求1所述用于细胞外囊泡的探针的化学结构，说明书还记载权利要求6～8任一用于细胞外囊泡的检测方法。
...【技术特征摘要】
1.一种用于细胞外囊泡的探针，其特征在于，所述用于细胞外囊泡的探针的化学结构式如式ⅰ所示：
2.如权利要求1所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，去除溶剂的方式包括真空蒸发、负压蒸发，温度不超过30℃。
4.根据权利要求2所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，如式ⅱ所示的化合物与n-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比1：(2.2～2.5)混合。
5.根据权利要求2所述用于细胞外囊泡的探针的制备方法，其特征在于，二甲基氨基吡啶的用量占步骤(2)混合液质量的4％～7％，n，n′-二环己基碳二亚胺与二甲基氨基吡啶的摩尔比为1：(0.95～1.05)。
6.一种用于细胞外囊泡的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述用于细胞外囊泡的检测方法，其特征在于，所述细胞外囊泡溶液的溶剂为dmem/f12完全培养基，细胞外囊泡的探针溶液的溶剂为p...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐智峰，张新，李智耀，
申请(专利权)人：广州沙艾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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