【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种裂解多糖单加氧酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用。
技术介绍
1、随着人口增长及资源日益消耗，全球资源和能源日益短缺，尤其是石油资源面临枯竭，因此需要寻求可替代能源。自然界中的植物生物质是现存最大的可再生资源，其中，木质纤维素来源广泛且可再生，是木材、秸秆的主要结构成分，可以作为生物发酵、生物化工产业的原料，被认为是极具潜力的第二代生物炼制原料，在转化为绿色生物燃料和增值化学原料方面具有广阔的应用前景。
2、木质纤维素主要组分为纤维素，半纤维素和木质素，这三者以多种形式相互作用缠绕一起，形成复杂的三维网状结构，导致其难以被有效利用。目前，木质纤维素转化主要包括预处理、酶解糖化以及发酵3个步骤。预处理主要是利用物理化学等方法破坏木质纤维素的结构，为后期酶的作用提供更多位点。虽然预处理能在一定程度上破坏木质纤维素的结构，但预处理后仍存在绝大多数晶体或微晶状态的纤维素。酶解糖化即利用纤维素酶将纤维素转化为葡萄糖，该步骤是木质纤维素生物转化可行性的决定性因素。目前纤维素酶主要由内切纤维素酶、外切纤维素酶及β-葡萄糖苷酶组成。在三者的共同作用下，可以降解部分纤维素获得葡萄糖，但是对结晶纤维素的水解效率依然很低。
3、裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases, lpmos)作为一种辅助活性酶，能够通过氧化机制裂解糖苷键，有效提高多糖水解程度，是极具开发潜力的木质纤维素降解酶，为秸秆中的木质纤维素的酶法降解提供了新的见解。大多数l
4、蛋白质工程常利用非理性分子设计和理性和半理性分子设计方式来改造蛋白质。非理性分子设计主要利用易错pcr技术，借助高通量筛选方法，获得性能优良的突变体。这种方式的优点是不需要明确蛋白的三维结构，但存在筛选工作繁琐的缺点。理性设计和半理性设计是在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建新的蛋白质分子。相较于非理性设计，理性设计拥有工作量小，更易获得有效突变体的优点。
5、因此，本专利技术中，通过对来源于 rhypophila decipiens的裂解性多糖单加氧酶基因进行理性设计，突变筛选得到热稳定性提高的裂解性多糖单加氧酶突变体基因。随后利用毕赤酵母表达系统，表达制备了耐热性能提升的裂解性多糖单加氧酶突变体，并实现了其在秸秆木质纤维素高效糖化中的应用。
技术实现思路
1、为了获得热稳定性提升的裂解性多糖单加氧酶，需对其现有性质作进一步改造，本专利技术的目的在于提供一种耐高温的裂解性多糖单加氧酶突变体。将 rhypophila decipiens来源的裂解性多糖单加氧酶基因（ lpmo）在毕赤酵母中进行表达；利用定点突变技术对基因 lpmo突变，筛选热稳定性提高的突变体，并实现了其在秸秆木质纤维素高效糖化中的应用。
2、实现本专利技术目的的技术路线概述如下：
3、对来源于 rhypophila decipiens的裂解性多糖单加氧酶基因 lpmo进行突变，利用毕赤酵母表达系统筛选得突变体a31q/t39v，获得编码基因 lpmom。突变体a31q/t39v的活力提高到野生型裂解性多糖单加氧酶（lpmo）的121%，在70 ℃下的半衰期提高到野生型裂解性多糖单加氧酶（lpmo）的129%。
4、本专利技术提供的技术方案之一，是一种裂解性多糖单加氧酶突变体，所述突变体是在seq id no.1所示野生型裂解性多糖单加氧酶基础上，发生a31q和t39v突变获得的，将所述突变体命名为a31q/t39v；
5、进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶突变体a31q/t39v，氨基酸序列如seq idno.3所示；
6、更进一步地，所述a31q/t39v突变体的编码基因 lpmom，核苷酸序列如seq id no.4所示。
7、本专利技术提供的技术方案之二，是包含上述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株；
8、进一步地，采用的表达载体为ppic9k，表达宿主 p. pastorisgs115。
9、本专利技术提供的技术方案之三，是上述重组质粒或重组菌株在生产技术方案一所述裂解性多糖单加氧酶突变体中的应用。
10、本专利技术提供的技术方案之四，是技术方案一所述裂解性多糖单加氧酶突变体的应用，特别是在降解木质纤维素中的应用，或是在协同纤维素酶降解木质纤维素中的应用，更特别地是在降解秸秆、竹子、甘蔗渣等木质纤维素原料中的应用，所述秸秆包括但不限于玉米秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆。
11、在本专利技术中采用如下定义：
12、1.氨基酸和dna核酸序列的命名法
13、使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用单字母或三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。
14、2. 裂解性多糖单加氧酶突变体的标识
15、采用“原始氨基酸+位置+替换的氨基酸”来表示lpmo突变体中突变的氨基酸。如a31q，表示位置31的氨基酸由野生型lpmo的ala替换成gln；t39v，表示位置39的氨基酸由野生型lpmo的thr替换成val。位置的编号对应于seq id no.1中野生型lpmo的氨基酸序列编号。
16、在本专利技术中，lpmo代表野生型裂解性多糖单加氧酶，a31q/t39v代表裂解性多糖单加氧酶突变体，小写斜体 lpmo表示野生型裂解性多糖单加氧酶lpmo的编码基因，小写斜体 lpmom表示突变体a31q本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种裂解性多糖单加氧酶突变体，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶突变体是在SEQ ID NO.1所示野生型裂解性多糖单加氧酶基础上，发生A31Q和T39V突变获得的，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因。
3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.包含权利要求2所述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株。
5.权利要求4所述重组质粒或重组菌株在生产权利要求1所述裂解性多糖单加氧酶突变体中的应用。
6.权利要求1所述裂解性多糖单加氧酶突变体的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，是在降解木质纤维素中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，是在降解秸秆、甘蔗渣或竹子中的应用。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，是在协同纤维素酶降解木质纤维素中的应用。
【技术特征摘要】
1. 一种裂解性多糖单加氧酶突变体，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶突变体是在seq id no.1所示野生型裂解性多糖单加氧酶基础上，发生a31q和t39v突变获得的，氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.权利要求1所述裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因。
3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.包含权利要求2所述突变体编...
【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，刘逸寒，孙慧，臧立华，赵蕾，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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