【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物领域，更具体地，涉及α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体及其应用和工程菌。
技术介绍
1、甾体类药物在治疗和预防疾病方面占据着全球除抗生素外需求量最大的重要地位，其中7羟基甾体类药物例如熊去氧胆酸、维生素类药物和神经活性类固醇可用于治疗炎症、胆汁淤积和慢性神经元损伤，因此合成该类药物的中间体，即7羟基甾体化合物极具价值。
2、目前一般通过高危化学试剂在甾体化合物c-7位上修饰改造，而间接获得羟基。此外还筛选出一些能够在c-7位上羟基化甾体底物的丝状真菌，通过微生物转化生产7羟基甾体化合物，但由于区域选择性不足且转化率低，这些菌株尚未在工业上应用。另外细胞色素p450加氧酶生物合成7羟基甾体化合物可以减少环境污染和副产物，但实际生产中需要昂贵的辅因子参与，还需要多种还原酶对来发挥作用。因此，有必要开发一种绿色高效的方法来生产合成7羟基甾体化合物。
技术实现思路
1、本公开以streptomycesplatensis cb00739来源的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶ptmo6为基础，通过基因工程及酶工程技术手段，对野生型ptmo6进行突变，所获得的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体较ptmo6催化效率显著提高，c-7位羟基化选择性明显提高。因此，显著降低了7羟基甾体化合物合成的生产成本和环境污染，更适用于工业化生产应用。
2、本公开的目的是提供一种高效合成7羟基甾体化合物的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体。该突变体较野生型的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有更
3、本公开提供了一种α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的序列包括seq id no.2-7中的至少一种。
4、本公开还提供了一种编码α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的基因序列，所述基因序列如seq id no.9-14所示。
5、本公开还提供了一种表达α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的重组基因工程菌。
6、本公开还提供了一种α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的应用，将所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体用于制备7-羟基甾体化合物。
7、在一些实施例中，将所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体与底物、fe2+、α-酮戊二酸混合，转化合成7-羟基甾体化合物。
8、在一些实施例中，所述底物包括雄甾-4-烯-3,17-二酮、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮、19-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮、3β-羟基-5-雄烯-17-酮、去氢表雄酮、石胆酸、黄体酮、双降醇和5α-雄甾烷二酮中的至少一种。
9、在一些实施例中，在转化合成反应体系中，底物投料量为2g/l，α-酮戊二酸投料量为2g/l，fe2+投料量为0.5mol/l。
10、在一些实施例中，在转化合成反应体系中，反应温度为30℃，反应时间为48h，反应搅拌转速为200r/min。
11、通过利用本公开的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体，较野生型酶转化率显著提高，催化成本和酶制备成本显著降低。
12、本公开选择streptomycesplatensis cb00739来源的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶ptmo6作为出发点，相比其它来源的氧化酶具有更高的异源表达量，稳定性好，反应条件简单，对底物选择性高，转化率高。在此基础上，本公开通过基因工程及酶工程技术手段，对ptmo6进行突变，所获得的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体较ptmo6的7羟基甾体化合物转化率显著提高，显著降低了催化成本和酶制备成本，使得更适合工业应用。
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1.一种α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体，其特征在于，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的序列包括SEQ ID NO.2-7中的至少一种。
2.一种编码根据权利要求1所述的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.9-14所示。
3.一种表达根据权利要求1所述的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的重组基因工程菌。
4.一种根据权利要求1所述的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的应用，其特征在于，将所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体用于制备7-羟基甾体化合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体与底物、Fe2+、α-酮戊二酸混合，转化合成7-羟基甾体化合物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述底物包括雄甾-4-烯-3,17-二酮、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮、19-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮、3β-羟基-5-雄烯-17-酮、去氢
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在转化合成反应体系中，底物投料量为2g/L，α-酮戊二酸投料量为2g/L，Fe2+投料量为0.5mol/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在转化合成反应体系中，反应温度为30℃，反应时间为48h，反应搅拌转速为200r/min。
...【技术特征摘要】
1.一种α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体，其特征在于，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的序列包括seq id no.2-7中的至少一种。
2.一种编码根据权利要求1所述的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的基因序列，其特征在于，所述基因序列如seq id no.9-14所示。
3.一种表达根据权利要求1所述的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的重组基因工程菌。
4.一种根据权利要求1所述的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体的应用，其特征在于，将所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体用于制备7-羟基甾体化合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶突变体与底物、fe2+、α-酮戊二酸混合，转化合成...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，宋士奎，吕德强，何建新，马倩倩，
申请(专利权)人：武汉艾默佳华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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