【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，具体涉及一种肠道免疫共培养模型及培养方法。
技术介绍
1、人类肠道因其在消化、吸收以及免疫调节方面的重要作用近年来受到广泛关注，尤其肠道粘膜中有超过70％的免疫细胞。虽然动物模型有助于对肠道免疫学的研究，但是种属差异限制了研究数据的可行性。
2、现有的肠道免疫模型集中于将肠上皮细胞和巨噬细胞培养于transwell模型中，肠上皮细胞和巨噬细胞分别置于顶端室和基底室，可以量化肠道上皮的屏障功能，通过多孔膜一定程度可以研究肠上皮细胞和巨噬细胞间的相互作用，但是该体系未进行肠上皮和黏膜免疫系统的整合，忽视了肠粘膜中的中性粒细胞浸润，而中性粒细胞是炎症反应中的关键影响因素。
3、因此，亟需一种肠道免疫共培养模型及培养方法，能够包含肠上皮细胞和多种免疫细胞的结构功能相互作用，并维持适当的屏障功能和黏膜免疫，以增强生理相关性。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种肠道免疫共培养模型及培养方法的新技术方案。
2、根据本专利技术的第一方面，提供了一种肠道免疫共培养模型，包括：
3、第一培养室、第二培养室和第三培养室，所述第一培养室嵌设于所述第二培养室的内侧，且所述第二培养室嵌设于所述第三培养室的内侧；所述第一培养室用于接种中性粒细胞，所述第二培养室用于接种肠上皮细胞和巨噬细胞，以在所述第二培养室中形成混合细胞层；
4、第一半透膜，所述第一培养室的底部形成第一开口，所述第一半
5、第二半透膜，所述第二培养室的底部形成第二开口，所述第二半透膜固定于所述第二培养室并封闭所述第二开口；
6、所述第一半透膜的孔径大于所述第二半透膜的孔径。
7、可选地，所述第一半透膜的孔径为4μm；所述第二半透膜的孔径为0.4μm。
8、可选地，所述第三培养室的底部为十二孔板，所述十二孔板的内表面上设置有培养孔。
9、可选地，所述第一半透膜与所述十二孔板的距离为15mm；所述第二半透膜与所述十二孔板的距离为8mm。
10、可选地，在混合细胞层中，肠上皮细胞和巨噬细胞的接种比例为9：1。
11、可选地，所述第一半透膜和第二半透膜的材质均为聚碳酸酯、聚酯或聚四氟乙烯。
12、根据本专利技术的第二方面，提供了一种肠道免疫共培养模型的培养方法，应用于如第一方面所述的肠道免疫共培养模型，包括如下步骤：
13、步骤s1，将人肠上皮细胞置于37度、含5％co2的条件下培养48h-72h，当细胞密度达到80％时，按照1：2-1：3比例传代，传两代后获得待接种的人肠上皮细胞；
14、步骤s2，将处在对数生长期的thp-1细胞中加入100ng/l的pma进行诱导，孵育24h后获得待接种的巨噬细胞；
15、步骤s3，采用细胞多功能包被液预处理第二培养室12h，随后吸去包被液备用；
16、步骤s4，将待接种的人肠上皮细胞和待接种的巨噬细胞按9：1比例制成细胞悬液后，按照基质胶和细胞悬液的比例为8：1混合均匀后接种至第二培养室，并放入37度、含5％co2培养箱半小时，随后向第二培养室内加入500ul培养基；
17、步骤s5，将中性粒细胞接种至第一培养室，并向第一培养室内加入150ul培养基，然后放入37度、含5％co2培养箱半小时；其中，培养基为90％rpmi-1640和10％胎牛血清；
18、步骤s6，将az31镁合金打磨后依次放入无水乙醇、丙酮中清洗10min，随后每侧紫外杀菌6h；然后，将清洗消毒后的az31镁合金放入第三培养室中，并加入1ml培养基；
19、步骤s7，将第一培养室嵌设于第二培养室的内侧；然后，将第二培养室嵌设于第三培养室的内侧；
20、步骤s8，每隔24h分别收集第一培养室、第二培养室和第三培养室中的培养基，采用bio-plex多重免疫法测量各个培养基中的炎症因子；其中，炎症因子至少包括il-1、il-4、il-6、il-8、il-10、tnf-α、tgf-β中的三种。
21、根据本专利技术的第三方面，提供了一种肠道免疫共培养模型的培养方法，应用于如第一方面所述的肠道免疫共培养模型，包括如下步骤：
22、步骤s1，将人肠上皮细胞置于37度、含5％co2的条件下培养48h-72h，当细胞密度达到80％时，按照1：2-1：3比例传代，传两代后获得待接种的人肠上皮细胞；
23、步骤s2，将处在对数生长期的thp-1细胞中加入100ng/l的pma进行诱导，孵育24h后获得待接种的巨噬细胞；
24、步骤s3，采用细胞多功能包被液预处理第二培养室12h，随后吸去包被液备用；
25、步骤s4，将待接种的人肠上皮细胞和待接种的巨噬细胞按9：1比例制成细胞悬液后，按照基质胶和细胞悬液的比例为8：1混合均匀后接种至第二培养室，并放入37度、含5％co2培养箱半小时，随后向第二培养室内加入500ul培养基；
26、步骤s5，将中性粒细胞接种至第一培养室，并向第一培养室内加入150ul培养基，然后放入37度、含5％co2培养箱半小时；其中，培养基为90％rpmi-1640和10％胎牛血清；
27、步骤s6，将第一培养室嵌设于第二培养室的内侧；然后，将第二培养室嵌设于第三培养室的内侧；然后，将所述肠道免疫共培养模型置于37度、含5％co2培养箱中培养24h；
28、步骤s7，在第二培养室中加入浓度为100ug/ml的脂多糖lps诱导炎症，并置于37度、含5％co2培养箱中培养24h；
29、步骤s8，采用跨膜电阻仪测量巨噬细胞和肠上皮细胞层的屏障功能，采用鬼笔环肽alexa fluortm488对中性粒细胞进行染色，以观察中性粒细胞的迁移和侵袭；
30、步骤s9，每隔24h分别收集第一培养室、第二培养室和第三培养室中的培养基，采用bio-plex多重免疫法测量各个培养基中的炎症因子；其中，炎症因子至少包括il-1、il-4、il-6、il-8、il-10、tnf-α、tgf-β中的三种。
31、可选地，在步骤s1中，人肠上皮细胞的培养基为89％的dmem、20％胎牛血清和1％的链霉素、青霉素。
32、可选地，在步骤s2中，巨噬细胞的培养基为89％的dmem、20％胎牛血清和1％的链霉素、青霉素。
33、本专利技术的一个技术效果在于：
34、在本申请实施例中，第一方面，第一培养室、第二培养室和第三培养室为层层嵌套状态，且通过第一半透膜和第二半透膜分割不同细胞培养区间，由于第一半透膜的孔径大于第二半透膜的孔径，不同的半透膜孔径有助于模拟细胞的迁移和浸润。
35、第二方面，将肠上皮细胞和巨噬细胞共同接种于第二培养室中并形成混合细胞层，能够提供稳定的肠上皮和免疫功能。
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1.一种肠道免疫共培养模型，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的肠道免疫共培养模型，其特征在于，所述第一半透膜的孔径为4μm；所述第二半透膜的孔径为0.4μm。
3.根据权利要求2所述的肠道免疫共培养模型，其特征在于，所述第三培养室的底部为十二孔板，所述十二孔板的内表面上设置有培养孔。
4.根据权利要求3所述的肠道免疫共培养模型，其特征在于，所述第一半透膜与所述十二孔板的距离为15mm；所述第二半透膜与所述十二孔板的距离为8mm。
5.根据权利要求4所述的肠道免疫共培养模型，其特征在于，在混合细胞层中，肠上皮细胞和巨噬细胞的接种比例为9：1。
6.根据权利要求5所述的肠道免疫共培养模型，其特征在于，所述第一半透膜和第二半透膜的材质均为聚碳酸酯、聚酯或聚四氟乙烯。
7.一种肠道免疫共培养模型的培养方法，其特征在于，应用于如权利要求6所述的肠道免疫共培养模型，包括如下步骤：
8.一种肠道免疫共培养模型的培养方法，其特征在于，应用于如权利要求6所述的肠道免疫共培养模型，包括如下步骤：
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