【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒核酸检测，尤其涉及一种人细小病毒b19核酸检测方法、检测试剂盒和检测设备。
技术介绍
1、人细小病毒b19(hpvb19)是引发多种严重疾病的重要病因，包括心脏病、传染性红斑、慢性溶血性贫血患者发生再障危象、免疫抑制患者的慢性贫血以及孕期流产等。hpvb19的高感染率和广泛的临床影响，使得对该病毒的准确检测在医疗诊断和公共卫生管理中具有重要意义。
2、目前，hpvb19的传统检测方法主要基于血清学技术。常见的检测手段包括酶联免疫吸附试验(elisa)、荧光免疫法、放射免疫法以及捕获血黏附试验。这些方法通过检测受试样本中病毒特异性的igm和igg抗体来判断感染情况。血清学方法因其操作简便、结果可靠而被广泛应用。然而，这些方法的检测结果在很大程度上依赖于样本的质量、抗体的效价以及其他实验条件。
3、尽管血清学方法在病毒检测中应用广泛，但其局限性也非常明显。首先，这类方法的特异性和灵敏度受限于样本质量和抗体效价，导致假阳性和假阴性结果的发生。此外，血清学检测通常需要较长的窗口期才能检测到病毒感染，无法及时提供早期感染的诊断信息。对于急性期感染患者，传统血清学检测往往不能及时、准确地反映病毒负荷情况，从而影响临床诊断和治疗决策。
4、综合来看，现有的血清学检测方法在应对hpvb19感染的诊断需求时存在显著不足。这些不足包括样本依赖性强、检测灵敏度和特异性不稳定、无法及时提供早期感染信息等。针对这些问题，需要探索和发展更加可靠、高效的检测技术，以满足临床和公共卫生对hpvb19精准检测
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供一种人细小病毒b19核酸检测方法，包括：
2、提取目标样本dna；以及，设计分子信标探针和扩增引物中的上游引物及下游引物；其中，所述上游引物和所述下游引物中的靶标特异性序列均能与人细小病毒b19核酸的基因组dna特异性结合；所述下游引物中的tag序列包含有切刻酶识别和作用序列，并且与所述目标样本dna序列无特异性结合；
3、基于所述扩增引物、所述分子信标探针、dna聚合酶、切刻酶和所述目标样本dna配制反应体系；
4、基于所述反应体系进行等温扩增反应，并进行溶解曲线分析；
5、根据所述溶解曲线确认所述目标样本是否存在人细小病毒b19核酸。
6、优选地，所述下游引物包括第一下游引物和第二下游引物；所述靶标特异性序列包括第一特异性序列和第二特异性序列；
7、所述第一下游引物包括所述tag序列和所述第一特异性序列；
8、所述第二下游引物包括所述tag序列、所述第二特异性序列和标签序列；
9、所述标签序列与所述目标样本dna序列无特异性结合；并且，所述标签序列能在切刻酶作用下生成游离单链，并且能与所述分子信标探针结合，再通过聚合酶介导下形成双链结构；
10、优选地，所述第一下游引物和所述第二下游引物的长度相同；
11、优选地，所述第一下游引物和所述第二下游引物的长度均为29nt。
12、优选地，所述扩增引物中上游引物的核苷酸序列为：
13、5’-gaccacccccatgccttatc-3’。
14、优选地，所述扩增引物中第一下游引物的核苷酸序列为：
15、5’-ataagactcttgcccaggcttgtgtaagt-3’。
16、优选地，所述扩增引物中第二下游引物的核苷酸序列为：
17、5’-ttaccccaatagcaataagactcaacggg-3’。
18、优选地，所述分子信标探针的核苷酸序列为：
19、5’-fam-cccggccgtcaccgaactgtgcttaccccaatagcagccgg g-bhq1-3’。
20、优选地，所述反应体系中包括：
21、所述上游引物、所述第一下游引物、所述第二下游引物、所述分子信标探针、dna聚合酶、切刻酶、脱氧核糖核苷三磷酸、nacl、tris-hcl、mgcl2、重组白蛋白、所述目标样本dna和水；
22、优选地，以单管反应体系20μl计算，所述反应体系中各组分和加入量分别为：
23、所述上游引物浓度125-500nm；
24、所述第一下游引物浓度50-100nm；
25、所述第一下游引物浓度125nm-500nm；
26、所述分子信标探针浓度250nm-500nm；
27、dna聚合酶0.5unit-2unit；
28、切刻酶0.5unit-2unit；
29、脱氧核糖核苷三磷酸1.5mm-3mm；
30、nacl 100mm；
31、tris-hcl 50mm；
32、mgcl2 8mm；
33、重组白蛋白80μg/ml；
34、所述目标样本dna 2μl-5μl；
35、水为余量。
36、优选地，所述等温扩增反应的反应程序为：
37、55℃-60℃，40-60min；
38、95℃，10min；
39、60℃-85℃，0.3℃/s ramp，收集荧光，形成所述溶解曲线。
40、此外，为解决上述问题，本专利技术还提供一种检测试剂盒，采用如上述所述的人细小病毒b19核酸检测方法。
41、此外，为解决上述问题，本专利技术还提供一种检测设备，采用如上述所述的人细小病毒b19核酸检测方法。
42、本专利技术提供一种人细小病毒b19核酸检测方法、检测试剂盒和检测设备。其中，所述人细小病毒b19核酸检测方法，包括：提取目标样本dna；以及，设计分子信标探针和扩增引物中的上游引物及下游引物；其中，所述上游引物和所述下游引物中的靶标特异性序列均能与人细小病毒b19核酸的基因组dna特异性结合；所述下游引物中的tag序列包含有切刻酶识别和作用序列，并且与所述目标样本dna序列无特异性结合；基于所述扩增引物、所述分子信标探针、dna聚合酶、切刻酶和所述目标样本dna配制反应体系；基于所述反应体系进行等温扩增反应，并进行溶解曲线分析；根据所述溶解曲线确认所述目标样本是否存在人细小病毒b19核酸。本专利技术所提供的检测方法中，目标样本dna外其他组分可提前进行混合，体系配制及后续反应均简单易行，无需任何特殊处理，方便组配为试剂盒；检测体系，仅需普通定量pcr仪作为支撑，适宜在基础平台进行推广使用；最短可在60min内完成目标样本的检测，同时可在极短时间内完成结果的判定，方法简便，检测效率高，准确性高。
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1.一种人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，所述下游引物包括第一下游引物和第二下游引物；所述靶标特异性序列包括第一特异性序列和第二特异性序列；
3.如权利要求2所述人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，所述扩增引物中上游引物的核苷酸序列为：
4.如权利要求2所述人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，所述扩增引物中第一下游引物的核苷酸序列为：
5.如权利要求2所述人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，所述扩增引物中第二下游引物的核苷酸序列为：
6.如权利要求1所述人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，所述分子信标探针的核苷酸序列为：
7.如权利要求2所述人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，所述反应体系中包括：
8.如权利要求1所述人细小病毒B19核酸检测方法，其特征在于，所述等温扩增反应的反应程序为：
9.一种检测试剂盒，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述的人细小病毒B19核酸检测方
10.一种检测设备，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述的人细小病毒B19核酸检测方法。
...【技术特征摘要】
1.一种人细小病毒b19核酸检测方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述人细小病毒b19核酸检测方法，其特征在于，所述下游引物包括第一下游引物和第二下游引物；所述靶标特异性序列包括第一特异性序列和第二特异性序列；
3.如权利要求2所述人细小病毒b19核酸检测方法，其特征在于，所述扩增引物中上游引物的核苷酸序列为：
4.如权利要求2所述人细小病毒b19核酸检测方法，其特征在于，所述扩增引物中第一下游引物的核苷酸序列为：
5.如权利要求2所述人细小病毒b19核酸检测方法，其特征在于，所述扩增引物中第...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴鹏高，刘金辉，马军，王奇，颜桦，
申请(专利权)人：陕西佰美基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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