【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器，涉及荧光生物传感器，尤其涉及一种同时检测afb1和ota的荧光探针的制备方法及其应用。
技术介绍
1、真菌毒素是真菌在生长和繁殖过程中产生的天然次生代谢产物，目前已发现的真菌毒素的种类已达400多种，其中黄曲霉毒素b1(aflatoxin b1，afb1)、赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)等被认为具有强毒性。真菌毒素对人类健康造成潜在威胁，且多种真菌毒素共存时，由于协同作用导致毒性加倍，因此在食品运输、加工等领域需要严格监控和防范。afb1已被认为是世界上最强的自然致癌物之一，主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生。afb1的毒性强、耐高温、化学性质稳定，在油料、谷物和豆类等粮食中极易残留，污染食物危害人类健康。ota由赭曲霉菌、黑曲霉、碳青霉和疣青霉产生，存在于多种农作物和食品中，如谷物、婴儿食品、咖啡、牛奶、肉类、香料、啤酒、水果和坚果等。ota与蛋白质的亲和力很高，会在动物器官中积累，并可能造成污染携带。
2、真菌毒素对粮油食品的污染成为全世界共同关注的热点问题，然而目前的检测方法在微量真菌毒素污染和多种真菌毒素混合污染时存在一定缺陷，因此，构建一种快速灵敏、成本低廉的真菌毒素检测方法迫在眉睫。
3、本专利技术将两种核酸酶相结合，以新型双循环信号放大策略来提升传感器的灵敏度，利用核酸外切酶(exoⅲ)的两种酶切活性，在afb1/ota存在的情况下，适配体与互补
技术实现思路
1、针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是公开一种能够同时检测两种真菌毒素(afb1和ota)的荧光探针的制备方法。
2、为解决现有技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
3、一种同时检测afb1和ota的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
4、取0.5ml cqds、20mg edc和10mg nhs混合于1ml去离子水中，避光反应30min后得到羧基活化的cqds，加入500μl浓度为1μm的probe1/probe2，置于4℃摇床孵育过夜；将偶联完成的荧光探针用超滤管以8000rpm的转速离心5min以除去未偶联的probe1/probe2，所制备的cqds-probe于4℃保存。
5、本专利技术所述的cqds-probe为cqds1-probe1或cqds2-probe2，其中，cqds1的平均粒径为1.751nm，cqds2平均粒径为2.129nm。
6、本专利技术所述cqds为市售或自制，现公开一种制备方法：将抗坏血酸溶于乙醇和去离子水的离心管中，剧烈搅拌形成均一溶液，密封在高温高压高压釜中，140～180℃水热反应50～70min，优选160℃水热反应70min，自然冷却至室温，先用0.22μm的滤膜过滤，再以12000rpm的转速离心10min，即可得到双发射碳量子点cqds，其中，抗坏血酸、乙醇和去离子水的反应物料比为0.5～1g:12～15ml:6～8ml，优选0.8g:13ml:7ml。
7、若分离碳量子点，取双发射碳量子点加入过量氯仿剧烈震荡混合静置2h，即得到表面富含羧基的碳量子点，萃取纯化后，收集溶液并于4℃储存。
8、本专利技术的第二个目的在于，将上述所制得的cqds-probe应用于同时检测afb1和ota。
9、所述cqds-probe应用于同时检测afb1和ota，包括如下步骤：
10、(1)将互补dna即cdna，包括cdna1和cdna2；适配体apt，包括apt1和apt2，以及hairpin rna于95℃金属浴混合10min，自然冷却至室温，静置2h；
11、(2)配制含有相同浓度的afb1和ota溶液，所述浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、25、50ng·ml-1；将100μl含有浓度均为2μm的cdna1、cdna2、apt1和apt2的混合溶液分别加入到所述afb1和ota溶液之中，混合孵育20min后，再加入20μl浓度为2μm的hairpin rna和5μl浓度为0.6u·μl-1的exoⅲ，37℃孵育40min进行辅助循环回收，70℃反应10min灭活exoiii；
12、(3)向上述每个样品中分别加入0.2μl含有cas12a、crrna1、cas13a、crrna2的混合溶液和200μl的coooh-cqds-probe孵育40min并灭活，测量其荧光强度，绘制afb1的浓度与荧光强度的标准曲线以及ota的浓度与荧光强度的标准曲线；其中，所述cas12a、crrna1、cas13a、crrna2的浓度为10μm；荧光测量仪的激发波长为365nm，狭缝宽度为6；
13、(4)量取10μl待测自然阳性样品经预处理后的含afb1和ota的上清液，加入到100μl含有浓度均为2μm的cdna1、cdna2、apt1和apt2的混合溶液中，混合孵育20min后，再加入20μl浓度为2μm的hairpin rna和5μl浓度为0.6u·μl-1的exoⅲ，37℃孵育40min进行辅助循环回收，70℃反应10min灭活exo iii；继续加入0.2μl含有浓度均为10μm的cas12a、crrna1、cas13a和crrna2和200μl coooh-cqds-probe孵育40min并灭活，测量其荧光强度，代入步骤(3)中所得标准曲线，获得待测自然阳性样品的afb1和ota的浓度。
14、本专利技术较优公开例，步骤(3)或(4)中，所述coooh-cqds-probe是将10μl浓度为0.5mg·ml-1的coooh纳米片溶液加入到含有100μl的浓度为600nm的cqds1-probe1或cqds2-probe2之中，混合均匀而成。
15、本专利技术较优公开例，步骤(4)中，所述待测自然阳性样品为玉米、糯米或黑豆粉。
16、本专利技术用于检测afb1的线性范围为0.01-50ng·ml-1，检测限为3.1pg·ml-1；ota的线性范围为0.01-50ng·ml-1，检测限为3.5pg·ml-1。
17、所述含afb1的上清液，称取5g待测自然阳性样品，37℃，湿度50％，培养20d，加入乙腈-水(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测AFB1和OTA的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取0.5mL CQDs、20mg EDC和10mg NHS混合于1mL去离子水中，避光反应30min后得到羧基活化的CQDs，加入500μL浓度为1μM 的Probe1/Probe2，置于4℃摇床孵育过夜；将偶联完成的荧光探针用超滤管以8000rpm的转速离心5min以除去未偶联的Probe1/Probe2，所制备的CQDs-Probe于4℃保存；
2.根据权利要求1所述的同时检测AFB1和OTA的荧光探针的制备方法，其特征在于：所制备的CQDs-Probe为CQDs1-Probe1或CQDs2-Probe2，其中，CQDs1的平均粒径为1.751nm，CQDs2平均粒径为2.129nm。
3.根据权利要求1所述的同时检测AFB1和OTA的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述CQDs的制备方法包括：将抗坏血酸溶于乙醇和去离子水的离心管中，剧烈搅拌形成均一溶液，密封在高温高压高压釜中，160℃水热反应70min，自然冷却至室温，先用0.22μm的滤膜过滤，再以12000 rpm的
4.一种根据权利要求1-3任一所述方法制备得到的CQDs-Probe的应用，其特征在于：将其应用于同时检测AFB1和OTA。
5.根据权利要求4所述的CQDs-Probe的应用，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的CQDs-Probe的应用，其特征在于：步骤（3）中，荧光测量仪的激发波长为365nm，狭缝宽度为6。
7.根据权利要求5所述的CQDs-Probe的应用，其特征在于：步骤（3）或（4）中，所述CoOOH-CQDs-Probe是将10μL浓度为0.5mg·mL-1的CoOOH纳米片溶液加入到含有100μL的浓度为600nM的CQDs1-Probe1或CQDs2-Probe2之中，混合均匀而成。
8.根据权利要求5所述的CQDs-Probe的应用，其特征在于：步骤（4）中，所述待测自然阳性样品为玉米、糯米或黑豆粉。
9.根据权利要求5-8任一所述的CQDs-Probe的应用，其特征在于：用于检测AFB1的线性范围为0.01-50 ng·mL-1，检测限为3.1 pg·mL-1；OTA的线性范围为0.01-50 ng·mL-1，检测限为3.5 pg·mL-1。
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测afb1和ota的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取0.5ml cqds、20mg edc和10mg nhs混合于1ml去离子水中，避光反应30min后得到羧基活化的cqds，加入500μl浓度为1μm 的probe1/probe2，置于4℃摇床孵育过夜；将偶联完成的荧光探针用超滤管以8000rpm的转速离心5min以除去未偶联的probe1/probe2，所制备的cqds-probe于4℃保存；
2.根据权利要求1所述的同时检测afb1和ota的荧光探针的制备方法，其特征在于：所制备的cqds-probe为cqds1-probe1或cqds2-probe2，其中，cqds1的平均粒径为1.751nm，cqds2平均粒径为2.129nm。
3.根据权利要求1所述的同时检测afb1和ota的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述cqds的制备方法包括：将抗坏血酸溶于乙醇和去离子水的离心管中，剧烈搅拌形成均一溶液，密封在高温高压高压釜中，160℃水热反应70min，自然冷却至室温，先用0.22μm的滤膜过滤，再以12000 rpm的转速离心10 min，即得，其中，所述抗坏血酸、乙醇和去离子水的反应物料比为0.8 g:13 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李雅琪，孙青月，蒋欣容，陈昕，孔德昭，李诗洁，张琪，史巧巧，刘畅，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。