【技术实现步骤摘要】
本申请涉及病毒纯化，具体涉及一种慢病毒的纯化方法。
技术介绍
1、慢病毒(lvv)作为细胞与基因治疗领域最重要的载体，与其他逆转录病毒相比，慢病毒有其独特的优点：有更广泛的宿主，对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，使目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加；稳定表达，慢病毒可以将外源基因有效的整合到细胞染色体中，且目的基因对转录沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶细胞中得到持续高效稳定的表达。经过构建后的慢病毒载体可以携带大约5kb，甚至更长的目的基因。因此除了外源的short-hairpin rnas(shrnas)等小分子外，很多cdna也能被克隆进入慢病毒载体，当然随着目的基因长度的增加，其病毒滴度也会随之下降。基于慢病毒的优点，可以利用慢病毒载体系统进行转染目的基因或rnai基因的常规实验操作，同时慢病毒在基因编辑、基因治疗、转基因动物、药物研究等领域也发挥着重要作用。
2、lvv通常是来自hiv-1的改造，并具有许多相同的特征，如直径80-120nm的球形衣壳核和功能性酶，具有来自寄主细胞膜的被膜。lvv颗粒固有的复杂性和敏感性在加工过程中带来了颗粒热稳定性等挑战(例如，在37℃下的半衰期为7-8小时)。需要快速处理，对冻融次数，盐浓度，ph值，剪切力和缓冲渗透压都有一定的敏感性。
3、细胞培养采用贴壁培养和悬浮培养，大多采用hek293细胞通过三质粒或四质粒转染法进行慢病毒包装，贴壁培养转导效率较高约，50
4、目前慢病毒采用切向流过滤(tff)和层析相结合和的工艺进行纯化，纯化整体收率只有10-20％，纯化采用以琼脂或甲基丙烯酸甲酯接枝葡聚糖为基质的纯化填料，如core700，纯化流速慢，目前处理速度为0.5cv/min，病毒易失活，且杂蛋白除去率只有60％-80％，上述方法处理时间长，有研究表明，37℃下8小时，有效病毒样颗粒数就减少50％，剪切力高，纯化杂质含量高，约含有15％-10％左右的杂蛋白，病毒样活性不足50％，或采用现在captureselec lenti vsvg，由于病毒尺寸在80-200nm，慢病毒无法进入琼脂孔径，只能利用琼脂外表面积亲和捕获，且由于vsvg蛋白杂质较多，需要长时间通过tff来降低vsvg杂蛋白含量.单步收率只有50％左右，导致慢病毒包装企业纷纷弃用。也有采用deae琼脂进行纯化，收率60％左右，流速慢易流穿。或只采用tff和中空纤维进行反复过滤，存在难放大，处理时间长，易失活等风险。
5、随着细胞与基因治疗领域逐渐走向成熟，对慢病毒的高纯度，生产成本有了急切的需求，如何降本增效，且保证工艺稳定性，提高产品纯度，逐渐提到了各个cdmo和细胞基因疗法公司的日程表上。
技术实现思路
1、针对上述存在的技术局限性，本申请提出了一种慢病毒的纯化方法；其克服了
技术介绍
中提到的不足和缺陷。
2、为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
3、本申请的专利技术点是提供一种慢病毒的纯化方法，包括以下步骤：
4、s1.制作层析柱填料；
5、s2.制备慢病毒样液；
6、s3.采用磷脂亲和层析和vsvg假型亲和层析的双亲和方法对慢病毒进行纯化。
7、可选地，上述的慢病毒的纯化方法，所述步骤s1中，层析柱填料的制备方法具体为，先制备所需要的基质，并对基质进行亲水化改造，再采用马来酰胺类或其他试剂进行活化，与带有间隔臂和连接子的配基进行偶联即可。
8、可选地，上述的慢病毒的纯化方法，所述基质包括天然大分子糖类、高分子聚合物、无机材料以及复合材料中的一种或多种；所述天然大分子糖类优选为琼脂糖、葡聚糖或纤维素；所述高分子聚合物优选为甲基丙烯酸类聚合物、苯乙烯二乙烯苯聚合物、环氧树脂类聚合物或聚醚砜类聚合物；所述无机材料优选为二氧化硅或氧化铝；所述复合材料优选为磁珠。
9、基质及基质制作：基质包括但不限于现在市场上所存在的基质。
10、基质材料：天然大分子糖类：琼脂糖，葡聚糖，纤维素等；合成高分子聚合物：甲基丙烯酸类聚合物，苯乙烯二乙烯苯聚合物，环氧树脂类聚合物，聚醚砜类聚合物等；无机材料类：二氧化硅，氧化铝等；复合材料：磁珠等。
11、基质形状：膜状，微球，棒状，整体柱等。
12、可选地，上述的慢病毒的纯化方法，所述亲水化改造是在基质表面进行亲水化修饰，亲水化修饰材料包括但不限于葡聚糖、琼脂糖、纤维素、醋酸纤维素、淀粉、亲水多肽、亲水寡肽、亲水多肽、亲水蛋白质、亲水核酸链、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙烯酞胺、聚氨酷和聚肽胺中的一种或多种。
13、基质亲水化改造：采用聚合物物质做为基质时，需要做亲水化改造，改造是通过化学键结合至基质表面，或孔表面，以达到亲水化修饰目的，避免包膜(磷脂双分子层)的特异性吸附，所改造的材料列举如下：
14、1、天然大分子：
15、多糖类：
16、葡聚糖：葡聚糖平均分子量1-200000，优选葡聚糖500，葡聚糖1000，葡聚糖1500，葡聚糖2000，葡聚糖2500，葡聚糖3000，葡聚糖4000，葡聚糖5000，葡聚糖10000，葡聚糖20000，葡聚糖40000，葡聚糖50000，葡聚糖70000，葡聚糖100000，葡聚糖150000，葡聚糖200000；
17、琼脂糖，纤维素，醋酸纤维素，淀粉等；
18、多肽蛋白类：亲水单肽，寡肽，多肽，蛋白质等进行亲水化改造，序列由碱性侧链(例如，赖氨酸(k)，精氨酸(r)、组氨酸(h))；酸性侧链(例如天冬氨酸(d)、谷氨酸(e))；不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)，酪氨酸(y)，半胱氨酸(c)；非极性侧链(例如，丙氨酸(a)缬氨酸(v)，亮氨酸(l)，异亮氨酸(i)，脯氨酸(p)，苯丙氨酸(f)，薄荷氨酸(m)、色氨酸(w)、b-支链侧链(例如苏氨酸(t)、氨酸(v)、异亮氨酸(i))；和芳族侧链(例如酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、组氨酸(h))，及其他合成氨基酸如蛋氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，6-氨基己酸，氨基丁酸等；
19、核酸类：寡核苷酸，类核苷酸，核苷酸等亲水核苷酸链。
20、2、聚合物：
21、聚乙烯醇：外观是白色片状、絮状或粉末状固体，聚乙烯醇的聚合度分为超高聚合度(分子量25～30万)、高聚合度(分子量17～22万)、中聚合度(分子量12～15万)和低聚合度(2.5～3.5万)。醇解度一般有78％、88％、98％三种。部分醇解的醇解度通常为87％～89％，完全醇解的醇解度为98％～100％，例如：pva1399，pva1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种慢病毒的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，层析柱填料的制备方法具体为，先制备所需要的基质，并对基质进行亲水化改造，再采用马来酰胺类或其他试剂进行活化，与带有间隔臂和连接子的配基进行偶联即可。
3.根据权利要求2所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述基质包括天然大分子糖类、高分子聚合物、无机材料以及复合材料中的一种或多种；所述天然大分子糖类优选为琼脂糖、葡聚糖或纤维素；所述高分子聚合物优选为甲基丙烯酸类聚合物、苯乙烯二乙烯苯聚合物、环氧树脂类聚合物或聚醚砜类聚合物；所述无机材料优选为二氧化硅或氧化铝；所述复合材料优选为磁珠。
4.根据权利要求2所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述亲水化改造是在基质表面进行亲水化修饰，亲水化修饰材料包括但不限于葡聚糖、琼脂糖、纤维素、醋酸纤维素、淀粉、亲水多肽、亲水寡肽、亲水多肽、亲水蛋白质、亲水核酸链、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙烯酞胺、聚氨酷和聚肽胺中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的慢病毒的纯化方法
6.根据权利要求2所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述间隔臂为用于连接配基和亲和基质的短链；所述连接子为接入间隔臂一段且用于定点偶联亲水基质的具有特定官能团的物质。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，制备慢病毒样液的具体过程为：采用三质粒转染法进行慢病毒包装，收获HEK-293T细胞，经过澄清，深层过滤，换液，制成层析上样液体。
8.根据权利要求1-6任意一项所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述磷脂亲和层析的具体过程为：
9.根据权利要求1-6任意一项所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述VSVG假型亲和层析的具体过程为：
10.根据权利要求1-6任意一项所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，还包括有步骤S4的TFF换液和无菌过滤；其具体过程为：根据孔径大小，采用相对应的滤材，包括但不限于，膜包(囊式过滤器或平板过滤器)，中空纤维，单步或分步分离目标物质和杂质，过滤缓冲液为指定要求的上样缓冲液或制剂缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种慢病毒的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述步骤s1中，层析柱填料的制备方法具体为，先制备所需要的基质，并对基质进行亲水化改造，再采用马来酰胺类或其他试剂进行活化，与带有间隔臂和连接子的配基进行偶联即可。
3.根据权利要求2所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述基质包括天然大分子糖类、高分子聚合物、无机材料以及复合材料中的一种或多种；所述天然大分子糖类优选为琼脂糖、葡聚糖或纤维素；所述高分子聚合物优选为甲基丙烯酸类聚合物、苯乙烯二乙烯苯聚合物、环氧树脂类聚合物或聚醚砜类聚合物；所述无机材料优选为二氧化硅或氧化铝；所述复合材料优选为磁珠。
4.根据权利要求2所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述亲水化改造是在基质表面进行亲水化修饰，亲水化修饰材料包括但不限于葡聚糖、琼脂糖、纤维素、醋酸纤维素、淀粉、亲水多肽、亲水寡肽、亲水多肽、亲水蛋白质、亲水核酸链、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙烯酞胺、聚氨酷和聚肽胺中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述配基为能够对目标分子表面的磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰肌醇(pi)和磷脂酸(pa)进行特异性吸附的基团，或在钙离子存在的情况下与外泌体膜表面的磷酯酰丝氨酸(p...
【专利技术属性】
技术研发人员：邢郁明，夏梦雨，陈晓凌，
申请(专利权)人：无锡萃纯生物材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。