【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物检测，涉及一种用于sdc2基因甲基化可视化、快速检测的试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，早筛早诊对患者的生存至关重要。结直肠癌的发生受许多因素的影响，但是结直肠癌早期临床表现并不突出，当出现便血、腹痛、体重下降、贫血、肠梗阻等症状时，病情已至中晚期，因此进行结直肠癌的早期诊断具有重要意义。结肠镜检测作为结直肠癌的鉴别金标准，也存在着诸多不足，例如检查前需进行灌肠或导泻等繁琐的肠道准备，并且检查过程中患者需暴露隐私部位，如进行非全麻的普通结肠镜检查，整个检查过程也十分痛苦。肠镜检查过程中存在一定风险，行结肠镜检查会导致出血和穿孔发生。
2、另一方面，相较于正常组织，sdc2基因在结直肠癌组织中呈现高水平的甲基化现象，且在早期就已经发生了甲基化，早期结直肠癌细胞会向肠管内发生脱落，在粪便中检测到sdc2阳性结果可能要早于在血液中检测，因此可作为结直肠癌的诊断标志物。对于结直肠癌，黏结蛋白聚糖2(syndecan-2，sdc2)基因的甲基化发生在癌症早期。已有研究证明，粪便中脱落的肿瘤细胞检出sdc2基因甲基化，则提示了结直肠癌的发生风险的增加。现有技术通常采用的sdc2甲基化的方法包括荧光定量pcr法联合使用焦磷酸测序或亚硫酸盐测序中的至少一种进行定量和/或定性检测。例如亚硫酸盐测序方法，sdc2甲基化检测过程一般为以亚硫酸盐处理后dna片段作为模板，特异地设计一对引物用于扩增含待测甲基化位点的小片段dna，同时用
3、基于以上技术问题，现有技术亟需一种能够快速且直观地进行sdc2基因甲基化检测的方法，因此，本专利技术提供一种快速、准确、成本低且简单易行的sdc2基因甲基化的可视化检测方法，不再受检测场景的限制，尤其地，检测成本低，速度快，检测结果具有可视化的效果，相较结肠镜、粪便潜血试验等传统方式，在不需要taqman探针设计的基础上，对sdc2基因甲基化后直接进行pcr扩展，再结合侧向免疫层析试纸条进行可视化的sdc2基因甲基化的快速检测，同时，也能够省去了繁琐的肠道准备过程，且几乎不受饮食等因素的干扰，整个操作过程简单，保护患者隐私，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种用于sdc2基因甲基化可视化、快速检测的试剂盒及检测方法，以克服现有技术存在的不足。
2、为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括提供了一种sdc2基因甲基化的检测方法，包括采用pcr扩增和侧向免疫层析法分析结合的方法，对待测样本的sdc2基因甲基化进行可视化检测；所述待测样本为粪便样本。
3、优选地，所述pcr扩增包括将待测样本进行dna提取后作为目的基因，对所述目的基因进行甲基化处理，然后再进行所述pcr扩增；将扩增产物进行所述侧向免疫层析分析。
4、优选地，所述甲基化处理包括采用亚硫酸氢盐对所述待测样本的dna进行甲基化。
5、优选地，所述pcr扩增包括采用8对引物对进行扩增；在引物一端修饰链霉亲和素，引物另一端修饰生物素，将目的基因进行pcr扩增。
6、所述8对引物对包括：
7、第一引物对：第一正向引物和第一反向引物；所述第一正向引物的序列如seq idno：1所示；所述第一反向引物的序列如seq id no：2所示；
8、第二引物对：第二正向引物和第二反向引物；所述第二正向引物的序列如seq idno：5所示；所述第二反向引物的序列如seq id no：6所示；
9、第三引物对：第三正向引物和第三反向引物；所述第三正向引物的序列如seq idno：7所示；所述第三反向引物的序列如seq id no：8所示；
10、第四引物对：第四正向引物和第四反向引物；所述第四正向引物的序列如seq idno：13所示；所述第四反向引物的序列如seq id no：14所示；
11、第五引物对：第五正向引物和第五反向引物；所述第五正向引物的序列如seq idno：21所示；所述第五反向引物的序列如seq id no：22所示；
12、第六引物对：第六正向引物和第六反向引物；所述第六正向引物的序列如seq idno：23所示；所述第六反向引物的序列如seq id no：24所示；
13、第七引物对：第七正向引物和第七反向引物；所述第七正向引物的序列如seq idno：25所示；所述第七反向引物的序列如seq id no：26所示；
14、第八引物对：第八正向引物和第八反向引物；所述第八正向引物的序列如seq idno：27所示；所述第八反向引物的序列如seq id no：28所示。
15、进一步地，所述侧向免疫层析分析为胶体金免疫层析法；包括：所述目的基因若发生甲基化，检测线(t线)上的链霉亲和素会和所述扩增产物一端的生物素结合，所述扩增产物另一端的fitc会与金纳米粒子偶联的fitc抗体结合。
16、优选地，将所述扩增产物滴加至试纸条的样品垫上，反应3-5min后进行结果判断dna是否发生了甲基化，判断结果包括：
17、阴性反应：c线、t线均显色；
18、阳性反应：c线显色，t线不显色；
19、无效反应：若c线不显色，则检测失败或试纸条失效。
20、进一步地，作为本专利技术的另一个目的，还提供了侧向免疫层析试纸条，其制备方法包括：金纳米粒子的制备；金纳米粒子与fitc抗体偶联；检测线与控制线的制备；胶体金试纸条的组装。
21、在一些优选的实施方式中，所述金纳米粒子的制备包括将氯金酸加入柠檬酸三钠混合加热进行反应制备得到所述金纳米粒子溶液。
22、在一些优选的实施方式中，所述金纳米粒子与fitc抗体偶联包括：调节所述胶体金溶液的ph值，涡旋后加入fitc抗体，室温下摇晃，加入封闭剂，混匀，取上清进行重悬。
23、在一些优选的实施方式中，所述检测线与控制线的制备包括：配置链霉亲和素溶液和羊抗鼠二抗溶液，并分别均匀分布在硝酸纤维素膜上得到检测线(t线)和质控线(c线)，烘干；所述检测线固定有链霉亲和素，所述质控线固定有羊抗鼠二抗。
24、在一些优选的实施方式中，所述胶体金试纸条的组装包括分别将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫依次粘贴在塑料衬板上；所述胶体金结合垫上有胶体金标记的f本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种SDC2基因甲基化的可视化检测方法，其特征在于，包括采用PCR扩增和侧向免疫层析法分析结合的方法，对待测样本的SDC2基因甲基化进行可视化检测；所述待测样本为粪便样本。
2.根据权利要求1所述的SDC2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增包括将待测样本进行DNA提取后作为目的基因，对所述目的基因进行甲基化处理，然后再进行所述PCR扩增；将扩增产物进行所述侧向免疫层析分析。
3.根据权利要求2所述的SDC2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述甲基化处理包括采用亚硫酸氢盐对所述待测样本的DNA进行甲基化处理，使SDC2基因序列中未发生甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶不变。
4.根据权利要求2所述的SDC2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增包括采用8对引物对，对目的基因进行PCR扩增；
5.根据权利要求4所述的SDC2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述侧向免疫层析分析为胶体金免疫层析法；包括：所述目的基因若发生甲基化，检测线(T线)上的链霉亲和素会和所述扩增产物一端的生物素结
6.根据权利要求5所述的SDC2基因甲基化的检测方法，其特征在于，将所述扩增产物滴加至试纸条的样品垫上，反应3-5min后进行结果判断DNA是否发生了甲基化，判断结果包括：
7.一种侧向免疫层析试纸条，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的SDC2基因甲基化的检测方法；所述侧向免疫层析试纸条的制备方法包括：金纳米粒子的制备；金纳米粒子与FITC抗体偶联；检测线与控制线的制备；胶体金试纸条的组装。
8.根据权利要求7所述的侧向免疫层析试纸条，其特征在于，所述金纳米粒子的制备包括将氯金酸加入柠檬酸三钠混合加热进行反应制备得到所述金纳米粒子溶液；
9.根据权利要求8所述的侧向免疫层析试纸条，其特征在于，将目的基因经亚硫酸氢盐甲基化处理后进行PCR扩增得到扩增产物，将所述扩增产物滴加至所述侧向免疫层析试纸条的样品垫上进行SDC2基因甲基化的检测。
10.一种试剂盒，用于SDC2基因甲基化的检测；包括：采用如权利要求1-6任一项所述的检测方法；或，包括如权利要求7-9任一项所述的侧向免疫层析试纸条和PCR扩增试剂盒。
...【技术特征摘要】
1.一种sdc2基因甲基化的可视化检测方法，其特征在于，包括采用pcr扩增和侧向免疫层析法分析结合的方法，对待测样本的sdc2基因甲基化进行可视化检测；所述待测样本为粪便样本。
2.根据权利要求1所述的sdc2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述pcr扩增包括将待测样本进行dna提取后作为目的基因，对所述目的基因进行甲基化处理，然后再进行所述pcr扩增；将扩增产物进行所述侧向免疫层析分析。
3.根据权利要求2所述的sdc2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述甲基化处理包括采用亚硫酸氢盐对所述待测样本的dna进行甲基化处理，使sdc2基因序列中未发生甲基化的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶不变。
4.根据权利要求2所述的sdc2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述pcr扩增包括采用8对引物对，对目的基因进行pcr扩增；
5.根据权利要求4所述的sdc2基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述侧向免疫层析分析为胶体金免疫层析法；包括：所述目的基因若发生甲基化，检测线(t线)上的链霉亲和素会和所述扩增产物一端的生物素结合，所述扩增产物另一端的fitc...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝亚茹，陈琦，陈庚华，宗子文，
申请(专利权)人：安徽桐康医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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