【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株、构建及发酵生产方法。
技术介绍
1、甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate，mma）是合成聚甲基丙烯酸甲酯（polymma，pmma）的基本成分，pmma是一种用于家具、药物输送系统和假牙制造等广泛行业的材料。mma的直接微生物生产已被提出，然而，mma对微生物有毒，并且没有直接催化mma形成的。甲基苹果酸是l-异亮氨酸合成途径中的c5前体，在各种生物体中普遍存在。甲基苹果酸可以通过碱催化脱羧和在高温加压水中脱水转化为甲基丙烯酸（maa），这是一种mma前体。随后，在酸催化剂和甲醇存在下通过酯化从maa生产mma。因此，微生物甲基苹果酸合成与化学催化剂介导的mma转化相结合是一种经济高效且环保的替代方案。
2、已经鉴定出几种能够产生甲基苹果酸的代谢工程微生物，包括酵母和弧菌。此外，大肠杆菌因其独特的遗传背景、高生长速率和稳健性等独特特性而成为微生物细胞工厂中常用的底盘。代谢工程技术可以显著提高大肠杆菌mg1655和s17-3产生甲基苹果酸的能力。大肠杆菌中的甲基苹果酸合成途径仅由糖酵解前体（丙酮酸和乙酰辅酶a）启动的一步催化过程组成。因此，碳通过糖酵解流入乙酸合成途径、三羧酸循环（tca）或其他相关途径与甲基苹果酸合成竞争。因此，人们努力通过减弱这些竞争途径来增强甲基苹果酸的产生，包括乳酸和乙酸途径相关基因的缺失和降低tca循环中柠檬酸合酶的活性。这些菌株可将葡萄糖转化为甲基苹果酸，产量为46.2-60 g/l。在之前的研究中
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法。
2、本专利技术的再一目的是提供生产甲基苹果酸的方法。
3、本专利技术的再一目的是提供具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株。
4、根据本专利技术的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，包括以下步骤：
5、构建具有噬菌体抗性的大肠杆菌工程菌株：截掉大肠杆菌外膜铬铁转运体fhua的loop8的编码基因，其中，所述外膜铬铁转运体fhua的氨基酸序列如seq id no：4所示，核苷酸序列如seq id no：5所示，loop8的氨基酸序列如seq id no：6所示，核苷酸序列如seq idno：7所示；敲除大肠杆菌中的硫氧还蛋白编码基因trxa，核苷酸序列如seq id no：8所示；将来源于大肠杆菌3234/a的sspb、sspc、sspd和sspe操纵子分段敲入大肠杆菌bw25113基因组中的s9位点，其中，所述sspb、sspc、sspd和sspe操纵子的核苷酸序列分别如seq id no：9、seq id no：10、seq id no：11和seq id no：12所示；
6、构建 methanococcus jannaschii来源的甲基苹果酸合酶mjcima3.7的编码基因在启动子pj23100调控下的大肠杆菌表达载体，其中，所述甲基苹果酸合酶mjcima3.7的氨基酸序列如seq id no：2所示，其核苷酸序列如seq id no：3所示，所述启动子pj23100的核苷酸序列如seq id no：1所示；
7、在大肠杆菌中过表达所述甲基苹果酸合酶mjcima3.7的编码基因。
8、根据本专利技术的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
9、在大肠杆菌中异源表达 bifidobacterium adolescentis来源的双功能磷酸酮醇酶基因 bafxpk,所述双功能磷酸酮醇酶的氨基酸序列如seq id no：13所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no：14所示 ;
10、敲除大肠杆菌醋酸激酶a基因 acka，所述醋酸激酶a基因 acka的核苷酸序列如seqid no：16所示;
11、过表达磷酸转乙酰酶编码基因 pta，所述磷酸转乙酰酶编码基因 pta的核苷酸序列如seq id no：17所示。
12、根据本专利技术的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，
13、以启动子pj23102调控所述双功能磷酸酮醇酶基因 bafxpk表达，所述启动子pj23102的核苷酸序列如seq id no：15所示；
14、以启动子为ptrc调控所述磷酸转乙酰酶编码基因 pta表达，所述启动子为ptrc的核苷酸序列如seq id no：18所示。
15、根据本专利技术的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
16、将大肠杆菌中的编码半乳糖抑制蛋白 galr的基因替换为 zymomonas mobilis来源的编码半乳糖转运体 zmglf的基因，所述编码半乳糖抑制蛋白 galr的基因的核苷酸序列如seq id no：19，所述半乳糖转运体 zmglf的氨基酸序列如seq id no：21所示，密码子优化后的核苷酸序列如seq id no：22所示；
17、将大肠杆菌中由 ptsg基因编码的eiibcglc替换为大肠杆菌葡萄糖激酶编码基因 glk，其中 ，所述 ptsg基因的核苷酸序列如seq id no：20所示，所述大肠杆菌葡萄糖激酶编码基因 glk的核苷酸序列如seq id no：23所示。
18、根据本专利技术的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其中，以启动子pm12调控所述编码半乳糖转运体 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述大肠杆菌外膜铬铁转运体FhuA的Loop8的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述甲基苹果酸合酶MjCimA3.7的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，以启动子PJ23102调控所述双功能磷酸酮醇酶基因Bafxpk表达，所述启动子PJ23102的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
5.根据权利要求1所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程
7.由权利要求1~6中任意一项所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法所构建的大肠杆菌工程菌株。
8.一种发酵生产甲基苹果酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：上罐发酵权利要求7所述的大肠杆菌工程菌株，得到甲基苹果酸。
9.根据权利要求8所述的发酵生产甲基苹果酸的方法，其特征在于，发酵培养基的配方为：20 g/L 葡萄糖，14 g/L KH2PO4，4 g/L (NH4)2PO4，2 g/L Na2SO4，0.6 g/L MgSO4⋅7H2O，1.8 g/L 柠檬酸，加入1‰的微量元素溶液，其中，所述微量元素溶液包括：8.4 mg/L EDTA，2.5 mg/L CoCl2⋅6H2O，0.15 mg/L MnCl2⋅4H2O，1.5 mg/L CuCl2⋅2H2O，3 mg/L H3BO3，2.5mg/L Na2MoO4⋅2H2O，13 mg/L Zn(CH3COO)2⋅2H2O，10 g/L 柠檬酸铁。
10.根据权利要求8所述的发酵生产甲基苹果酸的方法，其特征在于，发酵过程中添加补料培养基，所述补料培养基的配方为：700 g/L葡萄糖，2 g/L MgSO4⋅7H2O，1‰微量元素溶液。
...【技术特征摘要】
1.一种构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述大肠杆菌外膜铬铁转运体fhua的loop8的编码基因的核苷酸序列如seq id no：7所示；所述甲基苹果酸合酶mjcima3.7的编码基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
3.根据权利要求1所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，以启动子pj23102调控所述双功能磷酸酮醇酶基因bafxpk表达，所述启动子pj23102的核苷酸序列如seq id no：15所示；
5.根据权利要求1所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建具有噬菌体抗性生产甲基苹果酸的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，以启动子pm12调控所述编码半乳糖转运体zmglf的基因和所述大肠杆菌葡萄糖激酶编码基因glk表达，所述启动子pm...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓璐，王听听，张杰，姚斌，罗会颖，黄火清，柏映国，苏小运，涂涛，张红莲，秦星，王苑，王亚茹，于会民，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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