【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及p450bm3突变体及其在维生素d3合成25-羟基维生素d3中的应用。
技术介绍
1、细胞色素p450酶是一类广泛存在于自然界不同生命体中的含有b型血红素的蛋白超家族，催化多种有机底物的单氧化，如类固醇、脂肪酸，通常被认为参与异种生物和药物的氧化代谢。其中，p450bm3是一种来自土壤细菌大肠杆菌(bacillusmegaterium)的细胞色素p450酶，已知具有高的催化活性和底物特异性。由于其能够执行多种不同的氧化反应，p450bm3在合成化学和工业生产中受到广泛关注。此外，p450bm3与其它p450酶相比，具有较高的溶解度和表达量，使其在科学研究和工业应用中具有优势。然而，野生型的p450bm3对许多化合物的催化效率不理想。为了提高其催化效率或改变底物特异性，研究人员对p450bm3进行了多次的定向进化和突变设计。
2、维生素d3(vd3)是一种第二类固醇，在人体皮肤中由前体化合物7-脱氢胆固醇在紫外线照射下产生，导致前体b环的开放，之后，vd3在肝脏和肾脏中依次代谢，形成两种对人类健康非常重要的衍生物，即25-羟基维生素d3和1α，25-二羟基维生素d3，其中，25-羟基维生素d3是血液中维生素d3最丰富的循环代谢物，因此被认为是患者维生素d3营养状况的最佳指标，保持25-羟基维生素d3的最佳水平对于降低多种慢性疾病或癌症的风险至关重要。此外，25-羟基维生素d3代谢物在某些补充剂处理中被认为具有更好的吸收特性。
3、25-羟基维生素d3的合成一般分为化学和生物合
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种p450bm3突变体及其在维生素d3合成25-羟基化维生素d3的应用，从而解决现有技术中p450bm3对其非天然底物维生素d3催化活性低导致产量低下难以用于工业生产的问题。
2、为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、根据本专利技术的第一方面，提供一种活性提高的催化维生素d3合成25-羟基维生素d3的p450bm3突变体，包括以seq id no.1所示野生型的p450bm3(来自巨型芽孢杆菌atcc14581的脂肪酸羟化酶cyp102a1)为模板，第87位氨基酸残基或第188位氨基酸残基发生如下突变形成的p45bm3酶突变体：第87位的苯丙氨酸f突变为丙氨酸i的p450bm3突变体f87i，氨基酸序列如seq id no.3所示；第87位的苯丙氨酸f突变为亮氨酸l的p450bm3突变体f87l，氨基酸序列如seq id no.4所示；第188位的亮氨酸l突变为天冬氨酸n的p450bm3突变体l188n，氨基酸序列如seq id no.5所示；第188位的亮氨酸l突变为半胱氨酸c的p450bm3突变体l188c，氨基酸序列如seq id no.6所示。
4、根据本专利技术的第二方面，提供一种所述p450bm3突变体的编码基因，该基因编码上面所述的p450bm3突变体f87i或f87l或l188n或l188c。这些突变体的编码基因分别如seqid no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10所示。
5、根据本专利技术的第三方面，提供包含所述编码基因的重组载体，该该重组基因上连接有上面所述的p450bm3突变体f87i或f87l或l188n或l188c，包括以下步骤：以seq idno.1所示野生型的p450bm3为模板，分别对第87位的f突变或第188位的l突变，形成p450bm3突变体f87i或f87l或l188n或l188c，插入表达质粒pet28a(+)，获得各种突变体质粒pet28a(+)-p450bm3。
6、根据本专利技术的第四方面，提供包含上述p450bm3突变体的编码基因的重组表达转化体f87i、f87l、l188n以及l188c，可通过将构建的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。
7、宿主细胞选自：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolitica)、克鲁斯假丝酵母(candida krusei)、东方伊萨酵母(issatchenkiaorientalis)、放线菌(actinomycetes)、链霉菌(streptomyces)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或大肠杆菌(escherichia coli)。
8、本专利技术首选大肠杆菌作为宿主细胞，优选大肠杆菌e.coli bl21(de3)用于高效表达本专利技术所述的p450bm3突变体f87i、f87l、l188n以及l188c。
9、根据本专利技术的第五方面，提供一种利用如前面所述的p450bm3突变体f87i或f87l或l188n或l188c在催化维生素d3生成25-羟基维生素d3中的应用。
10、优选地，本专利技术使用辅酶循环系统与所述p450bm3突变体f87i、f87l、l188n、l188c进行偶联，催化维生素d3生成25-羟基维生素d3的反应。其中酮还原酶83(ketoreductaseses-kred-183)用于实现辅酶nadph的循环，节省成本。
11、在所述应用中，包括以下步骤：1)在tb培养基中培养所述p450bm3突变体，至od600＝0.6-0.8，加入iptg诱导表达，获得粗酶液；2)以40～60％的质量体积比混合增溶剂羟丙基-β-环糊精和tris-hcl缓冲液，涡旋震荡后加入底物维生素d3，充分涡旋至澄清，使维生素d3的终浓度为0.1～0.3mm，加入辅酶循环系统和异丙醇，再加入所述粗酶液，在辅酶nadph的存在下进行，其中酮还原酶83用于实现辅酶nadph的循环，放入25～35℃恒温摇床中震荡10～15h，进行底物维生素d3的转化反应，即可实现25-羟基维生素d3的高效合成。
12、根据本专利技术的一个优选方案，所述应用包括以下步骤：s1：在tb培养基中培养所述突变体表达系统，诱导表达，获得粗酶液；s2：以50％的质量体积比混合增溶剂羟丙基-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于催化维生素D3合成25-羟基维生素D3的P450BM3突变体，其特征在于，所述P450BM3突变体包括以SEQ ID NO.1所示野生型的P450BM3为模板，第87位氨基酸残基或第188位氨基酸残基发生如下突变形成的P450BM3酶突变体：
2.一种编码如权利要求1所述的P450BM3突变体的基因。
3.一种包含如权利要求2所述的基因的重组质粒。
4.一种含有如权利要求3所述的重组质粒的重组基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，宿主细胞选自：酿酒酵母、解脂耶氏酵母、克鲁斯假丝酵母、东方伊萨酵母、放线菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌。
6.一种利用如权利要求1-5中任意一项所述的P450BM3突变体催化维生素D3合成25-羟基维生素D3的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用辅酶循环系统与所述P450BM3突变体进行偶联，催化维生素D3合成25-羟基维生素D3的反应，其中辅酶循环体系选自以下中的至少一种：
8.根据权利要求7所述的应用，其特
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述P450BM3突变体为P450BM3酶突变体L188N。
...【技术特征摘要】
1.一种用于催化维生素d3合成25-羟基维生素d3的p450bm3突变体，其特征在于，所述p450bm3突变体包括以seq id no.1所示野生型的p450bm3为模板，第87位氨基酸残基或第188位氨基酸残基发生如下突变形成的p450bm3酶突变体：
2.一种编码如权利要求1所述的p450bm3突变体的基因。
3.一种包含如权利要求2所述的基因的重组质粒。
4.一种含有如权利要求3所述的重组质粒的重组基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，宿主细胞选自：酿酒酵母、解脂耶氏酵母、克鲁斯...
【专利技术属性】
技术研发人员：王华磊，魏东芝，赵佳琪，景子健，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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