【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，尤其涉及家蝇pirk基因突变体及其在建立高产抗菌肽家蝇品系中的应用。
技术介绍
1、家蝇是一种世界性卫生昆虫，在杂菌横生的环境下生存，但自身不会被这些病原菌感染生病，其体内含有的多种抗菌肽是主导家蝇高效抵御病原体感染的重要效应分子。抗菌肽作为一种天然抗生素，具有抗菌谱广、作用机制独特、不易产生耐药性等优点，在医药、农业等领域具有广阔的应用前景。然而，自然状态下的家蝇抗菌肽诱导表达的强度和持续时间受到负性调控因子的调控作用，负性调控因子确保抗菌肽适时、适度的表达，避免抗菌肽表达不足或过度激活。pirk是一种关键的负性调控因子，它通过精准地调控免疫反应中的特定环节，实现抗菌肽快速表达以杀死细菌，或者在细菌清除后期抑制抗菌肽的过度表达，维持免疫系统的平衡和稳定。
2、crispr cas9技术已成为最主流的基因编辑工具，同时也是现有基因编辑和基因修饰方法中效率最高、最简便、成本最低且最容易操作的技术之一。在家蝇中鲜有利用crispr/cas9系统进行家蝇基因功能研究，而利用该技术敲除pirk基因，获得纯合突变体还未见报道。
3、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术基于pirk基因对抗菌肽表达的调控分子机制，通过对负性调控因子pirk进行基因改造，提出了一种家蝇pirk基因突变体及其应用。
2、具体的，本专利技术的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供了一种家蝇pirk基因突变体，其核苷酸序
4、第二方面，本专利技术提供了所述家蝇pirk基因突变体在提高家蝇抗菌肽表达水平中的应用。
5、优选地，所述家蝇抗菌肽选自cecropin、attacin、muscin和diptericin中的至少一种。
6、第三方面，本专利技术提供了所述家蝇pirk基因突变体在提高家蝇抗菌肽抑菌活性中的应用。
7、优选地，所述抑菌活性包括针对大肠杆菌的抑菌活性。
8、优选地，所述抑菌活性包括针对苏云金杆菌的抑菌活性。
9、优选地，所述抑菌活性包括针对伤寒杆菌的抑菌活性。
10、第四方面，本专利技术提供了所述家蝇pirk基因突变体在建立高产抗菌肽家蝇品系中的应用。
11、优选地，所述应用包括如下步骤：利用基因编辑技术将家蝇pirk基因编辑为权利要求1所述家蝇pirk基因突变体。
12、基于上述专利技术构思，本专利技术在一种优选且具体的实施方式中构建得到了一种pirk敲除的家蝇品系。该突变体品系的抗菌肽表达水平显著提高，提取的粗蛋白抑菌活性显著高于野生型家蝇。
13、作为本专利技术提供的一种优选且具体的实施方式，本专利技术提供了一种家蝇pirk基因编辑纯合突变体的构建方法，该方法利用基因编辑技术靶向pirk基因，构建家蝇的抗菌肽高产品系，其具体包括以下步骤：
14、（1）设计家蝇pirk基因的sgrna靶标位点；所述家蝇pirk基因的核苷酸序列如seqid no: 1所示。
15、（2）体外合成sgrna，将sgrna和cas9蛋白混合物通过显微注射技术注射到家蝇胚胎中，经孵化，饲养，分子筛选获得家蝇pirk基因敲除突变体。
16、在进一步的方案中，所述步骤（1）的sgrna靶标位点位于家蝇pirk基因唯一的一个外显子区域。
17、在进一步的方案中，所述sgrna的靶标位点序列为5’-tgtgcctcaaaagatccatgtgg-3'（seq id no: 3），其中tgg为pam序列。
18、在进一步的方案中，所述步骤（2）中的cas9蛋白和sgrna在混合物中的终浓度为300 ng/μl：200 ng/μl。
19、在进一步的方案中，所述步骤（2）中注射家蝇的卵选择在产卵20 min以内的新鲜卵，注射过程在2 h内完成。
20、在进一步的方案中，所述步骤（2）中的分子筛选具体为：
21、提取家蝇的基因组dna，利用如下引物对进行pcr扩增，纯化pcr产物，并测序检测家蝇的sgrna靶标位点是否发生突变。
22、f:5'-atacgtgtttatgacagcagcg-3'（seq id no.04），
23、r:5'- tacttgagatggccatgatttg -3'（seq id no.05）。
24、在进一步的方案中，家蝇的培养条件为温度28℃，湿度60%，光周期12 h：12 h。
25、通过检测家蝇pirk基因突变体对细菌生长的影响，结果显示，上述的家蝇pirk基因突变体冻干磨粉后的粗提物，对大肠杆菌、苏云金杆菌和伤寒杆菌的生长具有显著的抑菌活性。
26、有益效果：
27、本专利技术提供了一种家蝇pirk基因突变体及其应用。该家蝇pirk基因突变体的核苷酸序列如seq id no.8所示。基于本专利技术所述家蝇pirk基因突变体的家蝇纯合突变品系相较野生型家蝇的抗菌肽表达水平显著提升；抗菌肽粗提物对多种细菌的抑菌活性显著增强。
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1.家蝇pirk基因突变体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.权利要求1所述家蝇pirk基因突变体在提高家蝇抗菌肽表达水平中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述家蝇抗菌肽选自Cecropin、Attacin、Muscin和Diptericin中的至少一种。
4.权利要求1所述家蝇pirk基因突变体在提高家蝇抗菌肽抑菌活性中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抑菌活性包括针对大肠杆菌的抑菌活性。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抑菌活性包括针对苏云金杆菌的抑菌活性。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抑菌活性包括针对伤寒杆菌的抑菌活性。
8.权利要求1所述家蝇pirk基因突变体在建立高产抗菌肽家蝇品系中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，包括如下步骤：利用基因编辑技术将家蝇pirk基因编辑为权利要求1所述家蝇pirk基因突变体。
【技术特征摘要】
1.家蝇pirk基因突变体，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.8所示。
2.权利要求1所述家蝇pirk基因突变体在提高家蝇抗菌肽表达水平中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述家蝇抗菌肽选自cecropin、attacin、muscin和diptericin中的至少一种。
4.权利要求1所述家蝇pirk基因突变体在提高家蝇抗菌肽抑菌活性中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳峰松，唐婷，任煜，陈凯，杨兰，王鑫，张玉明，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：
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