【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学领域，具体地，涉及基因工程技术及微生物领域，尤其涉及一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌及其应用。
技术介绍
1、酵母是模式真核生物，遗传操作简单、蛋白质翻译后修饰和分泌途径较完备、生长速度快、营养要求低、适于大规模高密度发酵。随着对大量不同异源蛋白在酵母中分泌表达的研究发现，不同蛋白的表达量差异较大，有些异源蛋白质分泌能力有限，限制了蛋白质的生产效率。通过基因操作改良蛋白质生物合成、分泌机制的关键基因，是提高异源蛋白质生产效率的重要手段。
2、细胞壁是酵母细胞的重要组成部分，是细胞与外界隔离的屏障，维持细胞形态，并在细胞生长、分裂、条件应激、细胞融合交配以及维持细胞完整性等方面发挥关键作用。
3、酵母细胞壁主要由甘露糖蛋白、β-葡聚糖和少量的几丁质组成。酵母细胞壁β-葡聚糖是一种多分支聚合物，主链以β-1,3-糖苷键连接，通过β-1,6-糖苷键进行分支，形成一个网络状结构。几丁质是由n-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键聚合而成。甘露糖蛋白可以先通过共价键和细胞壁的β-1,6葡聚糖连接，再通过β-1,6葡聚糖与β-1,3葡聚糖相连，或者直接和β-1,3葡聚糖连接。几丁质也可以通过其还原末端的β-1,4-糖苷键与β-1,3-葡聚糖链的非还原末端连接，或者以β-1,3-葡聚糖链为侧链间接连在β-1,6葡聚糖链上（orlean,&p. (2012). architecture and biosynthesis of the saccharomycescerevisiae cel
4、多项研究发现细胞壁组成成分和结构的改变可影响蛋白质分泌。以生产异源β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母为出发菌株,构建细胞壁蛋白基因cwp2破坏菌株，发酵96小时后胞外β-葡萄糖苷酶的酶活性提高了53%，胞内酶活性提高了208%（李洁.破坏细胞壁蛋白cwp2基因提高重组酿酒酵母β-葡萄糖苷酶胞外酶活[j].微生物学通报,2020,47(03):681-690.）。中国科学院深圳先进技术研究院（cn113493800b）通过敲除酿酒酵母细胞壁相关蛋白dfg5从而使异源蛋白β-葡萄糖苷酶的分泌表达活性提高了3倍。中国农业大学通过敲除乳酸克鲁维酵母细胞壁合成相关基因kigas1-1，发现细胞壁厚度减小，并且提高了外源蛋白木聚糖酶b的分泌量（连昭.乳酸克鲁维酵母表达异源木聚糖酶b工程菌改造及蛋白分泌机制研究[d].中国农业大学,2015.）。
5、以上案例为通过构建高表达重组人白蛋白的重组工程菌提供了良好的示例。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种提高人重组白蛋白的重组工程菌，所述重组工程菌通过在表达重组人白蛋白的同时，利用crispr-cas9基因编辑技术靶向敲除ccw14、emw1、pun1中的一种或多种基因，和/或同时将exg1、spr1中的一种或多种基因过表达整合至菌株中，从而实现重组人白蛋白的高效表达，为重组人白蛋白的产业化应用奠定基础。
2、所述重组人白蛋白氨基酸序列如seq id no.11所示，核苷酸序列如seq id no.12或与seq id no.12至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。
3、进一步地，所述重组工程菌，利用crispr-cas9基因编辑技术靶向敲除ccw14、emw1、pun1中的一种或多种基因。包括以下步骤：
4、s1：构建cas9与grna共表达质粒；
5、s2：制备供体dna；
6、s3：制备感受态细胞；
7、s4：构建敲除ccw14、emw1、pun1中的一种或多种基因的菌株。
8、所述的ccw14基因核苷酸序列为编码序列为seq idno.2蛋白的核苷酸序列，优选地，所述ccw14基因核苷酸序列如seq id no.1所示，ccw14-grna序列如seq id no.13所示。
9、所述的emw1基因核苷酸序列为编码序列为seq idno.4蛋白的核苷酸序列，优选地，所述emw1基因核苷酸序列如seq id no.3所示，emw1-grna序列如seq id no.14所示。
10、所述的pun1基因核苷酸序列为编码序列为seq idno.6蛋白的核苷酸序列，优选地，所述pun1基因核苷酸序列如seq id no.5所示，pun1-grna序列如seq id no.15所示。
11、所述的cas9基因核苷酸序列如seq id no.16所示，所编码的氨基酸序列如seq idno.17所示。
12、所述的cas9与grna的重组表达盒是在一个核酸构建体上，以杀稻瘟菌素抗性标签筛选。
13、所述的供体dna，以毕赤酵母cbs7435基因组dna为模板，利用重叠延伸pcr技术得到ccw14基因、emw1基因和pun1基因左右同源臂片段。
14、进一步地，所述重组工程菌，还包括将编码exg1、spr1中的一种或多种基因过表达。优选地，编码exg1、spr1中的一种或多种基因的重组表达盒是在一个核酸构建体上或在不同选择标志的核酸构建体上。
15、所述的核酸构建体包括phil-d2、ppic3.5、phil-s1、ppic9、ppink-lc、ppink-hc、pgapza、pgapzaa质粒中的任意一种或者多种；重组启动子优先为组成型启动子，包括gap启动子、tef1启动子、pgk1启动子和hgt1启动子中的任意一种或者多种。
16、所述的spr1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.8所示； spr1基因核苷酸序列为编码序列为seq id no.8蛋白的核苷酸序列，包括目前数据库已公开的序列及根据实际需要进行优化的核苷酸序列。优选地，所述的spr1基因核苷酸序列如seq id no.7所示。
17、所述的exg1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.10所示；exg1基因核苷酸序列为编码序列为seq id no.10蛋白的核苷酸序列，包括目前数据库已公开的序列及根据实际需要进行优化的核苷酸序列。优选地，所述的exg1基因核苷酸序列如seq id no.9所示。
18、进一步地，所述重组工程菌中至少包含1个拷贝的编码重组人白蛋白的核苷酸序列。优选地，所述重组工程菌中编码重组人白蛋白的核苷酸序列拷贝数为1~5，在本专利技术实施例中，所述重组工程菌中编码重组人白蛋白的核苷酸序列拷贝数为3。
19、进一步地，所述重组工程菌还包括抗药性基因，便于重组工程菌株的筛选，优选地，所述重组工程菌包括杀稻瘟菌素blasticidin抗性基因、遗传霉素g418抗性基因中的一种或多种，更优选地， 重组工程菌包括杀稻瘟菌素blasticidin抗性基因的核苷酸序列如核苷酸序列如seq id no.20或与seq id no.20至少具有98％同一性的核苷酸序列所示；遗传霉素g本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌在表达重组人白蛋白的同时，还包含如下操作：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因，和/或将EXG1、SPR1中的一种或多种基因过表达整合至菌株中。
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述CCW14基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述EMW1基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述PUN1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述SPR1基因所编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述EXG1基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述CCW14基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述EMW1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PUN1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SPR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述EXG1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌中至少包含1个拷贝的编码重组人白蛋白的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌还包括抗药性基因片段和/或信号肽序列。
6.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因，包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，编码EXG1、SPR1中的一种或多种基因的重组表达盒是在一个核酸构建体上或在不同选择标志的核酸构建体上。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌由毕赤酵母CBS7435改造而成。
9.如权利要求1-8任一所述重组工程菌在制备重组人白蛋白和/或提高重组人白蛋白表达量中的应用。
10.一种制备重组人白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：采用如权利要求1-8任一所述的重组工程菌发酵制备重组人白蛋白。
...【技术特征摘要】
1.一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌在表达重组人白蛋白的同时，还包含如下操作：利用crispr-cas9基因编辑技术靶向敲除ccw14、emw1、pun1中的一种或多种基因，和/或将exg1、spr1中的一种或多种基因过表达整合至菌株中。
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述ccw14基因所编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述emw1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述pun1基因编码的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述spr1基因所编码的氨基酸序列如seq idno.8所示；所述exg1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.10所示。
3.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述ccw14基因核苷酸序列如seqid no.1所示；所述emw1基因核苷酸序列如seq id no.3所示；所述pun1基因核苷酸序列如seq id no.5所示；所述spr1基因核苷酸序列如seq id no.7所示；所述exg1基因核苷酸序列如se...
【专利技术属性】
技术研发人员：项炜，韩旭，王宁，龚国利，
申请(专利权)人：通化安睿特生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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