含有(-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌及其应用制造技术

技术编号：42743215 阅读：7 留言：0更新日期：2024-09-18 13:36

本发明专利技术公开了一种含有(‑)‑α‑红没药醇合酶突变体的酵母工程菌及其应用。本发明专利技术通过对(‑)‑α‑红没药醇合酶进行设计，获得高表达量的突变体，并将突变体与ERG20共表达、高表达代谢途径中关键限速酶、启动子删减降低副反应途径以及多拷贝策略，提高(‑)‑α‑红没药醇生物合成途径中的代谢通量。本发明专利技术构建的酵母工程菌的摇瓶发酵产量接近70 mg/L，相较于出发菌株提高了约35倍，在(‑)‑α‑红没药醇的生物发酵生产中具有广阔的应用前景。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物制药领域，涉及一种含有(-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌及其应用。

技术介绍

1、(-)-α-红没药醇((-)-α-bisabolol)，是一种从洋甘菊中分离提取的单环倍半萜醇，分子式为c15h26o。(-)-α-红没药醇通过诱导细胞周期停滞、线粒体死亡和抑制pi3k/akt信号通路，对a549 nsclc细胞产生抗癌作用，因此具有抗癌活性。(-)-α-红没药醇具有较低的生理毒性，还具有抗炎、杀菌、抗菌、皮肤舒缓和保湿的特性，已被用于药品和化妆品中。此外，(-)-α-红没药醇因其镇痛功能可能应用于临床。综上，(-)-α-红没药醇具有良好的应用价值和市场前景。

2、天然的(-)-α-红没药醇主要是从洋甘菊中提取，通过有机试剂萃取、多次减压蒸馏等提取手段制备，其提取过程比较复杂和繁琐。此外，植物提取的产量也比较低，周期较长。近年来，随着合成生物学技术的发展，已有研究采用微生物细胞工厂异源生物合成(-)-α-红没药醇，该方法能够提高效率、降低成本、打破自然条件限制，从而有效缓解榄香烯的供需矛盾。

3、目前生物合成(-)-α-红没药醇主要是表达(-)-α-红没药醇合酶来生成(-)-α-红没药醇。此外已经有在大肠杆菌和酿酒酵母中报道相关的合成基因，这为异源合成(-)-α-红没药醇奠定了良好的基础。毕赤酵母作为公认的生物安全菌株，其生长速度快，环境耐受性高，发酵条件简单，而且其表达蛋白的能力强，因此毕赤酵母有望作为理想的宿主来合成萜类产物。目前暂未有利用毕赤酵母生产(-)-α-红没药醇的相关报道。

技术实现思路

1、本专利技术的目的之一在于提供一种(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2、本专利技术的目的之二在于提供上述(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、本专利技术的目的之三在于提供含有(-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌，为含有以下任意一组导入基因的酵母工程菌：

4、(1)(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因；

5、(2)(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因和法尼基焦磷酸合酶erg20的编码基因；

6、(3)(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因、法尼基焦磷酸合酶erg20的编码基因、基因异戊烯基焦磷酸异构酶idi1的编码基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1thmg1的编码基因、甲羟戊酸激酶erg12的编码基因和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶erg19的编码基因。

7、本专利技术所述酵母为基因工程菌中常规使用的酵母，包括但不限于毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母等。在本专利技术具体实施方式中，以毕赤酵母gs115为例。

8、作为进一步优选方案，所述含有(-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌基因组中删减了角鲨烯合成酶erg9的启动子。

9、作为进一步优选方案，所述导入基因中，(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因为多拷贝，在本专利技术具体实施方式中，以3拷贝为代表例。

10、本专利技术的目的之四在于提供上述含有(-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：

11、(1)将cas9核酸酶编码基因整合到酵母的基因组中，获得出发菌株，然后将(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因整合到出发菌株的基因组中，获得酵母工程菌1；

12、或(2)在酵母工程菌1的基础上，将erg20-linker融合基因整合到酵母工程菌1的基因组中，获得酵母工程菌2；

13、或(3)在酵母工程菌2的基础上，将3羟基3甲基戊二酰辅酶a还原酶异戊烯基焦磷酸异构酶idi1的编码的编码基因、1thmg1编码的编码基因、甲羟戊酸激酶erg12的编码基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶erg19的编码基因整合到酵母工程菌ccbos-2的基因组中，获得酵母工程菌3；

14、或(4)在酵母工程菌3的基础上，利用基因编辑技术删减基因组上角鲨烯合成酶erg9的启动子，获得酵母工程菌4；

15、或(5)在酵母工程菌4的基础上，将1个以上单拷贝的(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因整合到酵母工程菌4中，获得酵母工程菌5。

16、本专利技术的目的之五在于提供上述含有(-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌在生产(-)-α-红没药醇中的应用。

17、本专利技术通过对(-)-α-红没药醇合酶进行设计，获得了6种突变体，并从中筛选出(-)-α-红没药醇表达量相对于原始(-)-α-红没药醇合酶提高46％的突变体mut4(f324y)。在此基础上，本专利技术组装linker促进法尼基焦磷酸合酶erg20和红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的融合表达。随后高表达异戊烯基焦磷酸异构酶idi1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1thmg1、甲羟戊酸激酶erg12和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶erg19，进一步提高代谢通量。本专利技术还通过删减启动子下调角鲨烯合成酶erg9的表达，提升(-)-α-红没药醇表达量。此外，本专利技术通过增加(-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)拷贝数，大幅度提升(-)-α-红没药醇表达量。

18、相对于现有技术，本专利技术具有如下优点：

19、(1)本专利技术通过对(-)-α-红没药醇合酶进行设计，获得高表达量的突变体，并将突变体与erg20共表达、高表达代谢途径中关键限速酶、启动子删减降低副反应途径以及多拷贝策略，提高(-)-α-红没药醇生物合成途径中的代谢通量。

20、(2)本专利技术利用酵母高效生成(-)-α-红没药醇，具有周期短，环保和节约资源的特点，获得的重组菌株的摇瓶发酵产量接近70mg/l，相较于出发菌株提高了约35倍，且重组菌株的耐受性更强，在(-)-α-红没药醇的生物发酵生产中具有广阔的应用前景。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1. (-)-α-红没药醇合酶突变体Mut4(F324Y)，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. (-)-α-红没药醇合酶突变体Mut4(F324Y)的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 含有 (-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌，其特征在于，为含有以下任意一组导入基因的酵母工程菌：

4.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母、酿酒酵母或解脂耶氏酵母。

5.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母GS115。

6.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌的基因组中删减了角鲨烯合成酶ERG9的启动子。

7.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述导入基因中，权利要求1所述的(-)-α-红没药醇合酶突变体Mut4(F324Y)的编码基因为多拷贝。

8.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述导入基因中，权利要求1所述的(-)-α-红没药醇合酶突变体Mut4(F324Y)的编码基因为3拷贝。

9. 根据权利要求3所述的含有 (-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：

10. 根据权利要求3所述的含有 (-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌在生产(-)-α-红没药醇中的应用。

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【技术特征摘要】

1. (-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示。

2. (-)-α-红没药醇合酶突变体mut4(f324y)的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.2所示。

3. 含有 (-)-α-红没药醇合酶突变体的酵母工程菌，其特征在于，为含有以下任意一组导入基因的酵母工程菌：

4.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母、酿酒酵母或解脂耶氏酵母。

5.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母gs115。

6.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：程锦涛，蒲中机，杨桂玲，姚燕来，靳远祥，闻正顺，陈佳莉，陈定锋，李宝先，
申请(专利权)人：湘湖实验室农业浙江省实验室，
类型：发明
国别省市：

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