【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的无需扩增的afb1适配传感器及其制备和检测方法，特别是涉及应用于食品安全监测的一种无需扩增的afb1适配传感器及其制备和检测方法。
技术介绍
1、黄曲霉毒素b1（afb1）是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的剧毒真菌毒素，具有极强的致癌、致畸、致突变作用，被国际癌症研究机构列为一类致癌物。afb1主要污染谷物、坚果、油料等农产品，通过食物链进入人体，严重危害人类健康。因此，对afb1的高灵敏、快速检测对于预防afb1污染、保障食品安全和消费者健康具有重要意义。
2、目前，afb1的检测方法主要包括色谱法、免疫分析法和核酸扩增法等。色谱法如高效液相色谱法（hplc）和液相色谱-质谱联用法（lc-ms），灵敏度高、特异性强，但仪器昂贵、操作复杂、不适合现场快速检测。免疫分析法如酶联免疫吸附测定（elisa）操作相对简单，但特异性和灵敏度有限。核酸扩增法如聚合酶链式反应（pcr）和核酸序列扩增技术（nasba）等，具有高灵敏度和特异性，但需要复杂的样品前处理和核酸提取纯化步骤，检测成本较高。
3、中国专利技术专利cn114354591b公开了一种黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法。该方法利用信号探针as-afb1和识别探针fe3o4@cooh@ab-afb1构建了一种双功能探针，实现了对afb1的裸眼可视化检测，具有检出限低、线性范围宽、灵敏度高、特异性强等优点。但该方法仍然依赖于抗体分子的使用，抗体的制备成本较高，稳定性和重复性有待提高，且抗原抗体反应易受外界条件的影响。>
4、中国专利技术专利cn112816450b公开了一种基于dna walker结构和发卡探针构建超支化荧光纳米树的afb1检测方法。该方法巧妙地利用dna walker实现了信号放大，有效提高了afb1的检测灵敏度。但该方法需要多种dna探针的设计与合成，操作相对复杂，且dnawalker结构的稳定性和实际样品中的适用性有待进一步验证。
5、上述专利虽然在一定程度上实现了afb1的快速、灵敏检测，但仍存在检测成本高、操作繁琐、实际应用性不强等局限性。此外，现有方法大多需要对待测样品进行核酸提取等前处理，难以实现afb1的直接快速检测。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术要解决的技术问题是提供一种无需扩增的afb1适配传感器及其制备方法和检测方法，采用fe-n-c单原子纳米酶的高催化活性和crispr-cas12a系统的信号放大策略，结合afb1适配体的特异性识别，实现了对afb1的超灵敏、高特异性检测，无需对样品进行预扩增处理，操作简单，灵敏度高，特异性强，有望在食品安全监测、环境污染物筛查等领域实现afb1的现场快速检测，具有良好的应用前景。
2、为解决上述问题，本专利技术提供了一种无需扩增的afb1适配传感器及其制备和检测方法，包括fe-n-c单原子纳米酶、fe-co磁性纳米颗粒、黄曲霉毒素（afb1）适配体和crispr-cas12a系统；
3、fe-n-c单原子纳米酶通过热解法制备，fe-n-c单原子纳米酶具有过氧化物酶样活性；
4、fe-co磁性纳米颗粒通过热解法制备，用于实现磁分离和信号放大；
5、黄曲霉毒素（afb1）适配体，用于特异性识别afb1并激活crispr-cas12a的反式切割活性；
6、crispr-cas12a系统，包括cas12a蛋白和特异性crrna,cas12a蛋白和特异性crrna与afb1适配体共同构成afb1识别和信号放大单元；
7、fe-n-c单原子纳米酶和fe-co磁性纳米颗粒的纳米复合物通过ssdna连接作为比色反应的催化剂和信号放大单元；
8、afb1适配传感器的检出限优选为1.5×10-7 ng/μl，优选无需对待测样品进行预扩增处理。
9、在上述无需扩增的afb1适配传感器及其制备和检测方法中，利用fe-n-c单原子纳米酶的高效过氧化物模拟活性，催化h2o2产生•oh自由基，将无色的显色底物tmb氧化为有色的tmb+，引起溶液的颜色变化。通过将fe-n-c纳米酶和fe-co磁性纳米颗粒通过ssdna连接形成复合纳米探针，可实现磁分离富集放大和crispr-cas12a介导的特异性信号转导。当afb1存在时，afb1适配体与靶标结合并激活crispr-cas12a，使其产生非特异性的ssdna切割活性，释放出游离的fe-n-c纳米酶，催化tmb底物显色。afb1浓度越高，释放的fe-n-c纳米酶越多，催化产生的tmb+也越多，引起的颜色变化越明显。通过建立tmb显色反应的颜色变化或吸光度变化与afb1浓度的关系，即可实现afb1的定量检测。
10、作为本申请的进一步改进，fe-n-c单原子纳米酶中fe原子优选通过n原子与c骨架配位形成fe-nx活性位点，fe-co磁性纳米颗粒的直径优选为600nm。
11、作为本申请的再进一步改进，crispr-cas12a系统中cas12a蛋白与crrna的摩尔浓度比优选为1:0.5，ssdna的长度优选为81个核苷酸。
12、作为本申请的更进一步改进，包括以下步骤；
13、s1、通过热解法制备fe-n-c单原子纳米酶和fe-co磁性纳米颗粒；
14、s2、将fe-n-c单原子纳米酶和fe-co磁性纳米颗粒按适当比例混合，再通过ssdna连接形成纳米复合物；
15、s3、将步骤s2中的纳米复合物与afb1适配体、cas12a蛋白和crrna混合，构建完整的afb1适配传感器。
16、作为本申请的又一种改进，步骤s1中fe-n-c单原子纳米酶的制备包括，将2-甲基咪唑、zn(no3)2·6h2o和一定量的血红素混合，在n2气氛下于900℃热解2小时，随后自然冷却至室温，所得产物即为fe-n-c单原子纳米酶，fe-n-c单原子纳米酶，其中fe、n、c的摩尔比优选为160:1:1。
17、作为本申请的又一种改进的补充，步骤s1中fe-co磁性纳米颗粒的制备包括，将co(no3)2·6h2o、fe(no3)3·9h2o和2-甲基咪唑混合，搅拌并冷冻干燥，所得前驱体在900℃下热解2小时，得到fe-co磁性纳米颗粒。
18、作为本申请的又一种改进的补充，包括以下步骤；
19、s4、将待测样品与afb1适配体混合，使afb1与适配体结合；
20、s5、加入cas12a蛋白、crrna和fe-n-c/fe-co mnps纳米复合物，在37℃条件下反应60分钟；
21、s6、通过磁分离收集上清液，加入过氧化氢和四甲基联苯胺（tmb），在37℃条件下反应10分钟；
22、s7、根据反应体系颜色变化或650 nm吸光度判定afb1的存在或含量；
23、优选地，afb1浓度在1×10-6 ~ 1 ng/μl范围内时，其浓度与650 nm吸光度呈线性相本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无需扩增的AFB1适配传感器，其特征在于：包括Fe-N-C单原子纳米酶、Fe-Co磁性纳米颗粒、黄曲霉毒素（AFB1）适配体和CRISPR-Cas12a系统；
2.根据权利要求1所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器，其特征在于：所述Fe-N-C单原子纳米酶中Fe原子优选通过N原子与C骨架配位形成Fe-Nx活性位点。
3.根据权利要求1所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器，其特征在于：所述Fe-Co磁性纳米颗粒的直径优选为600nm。
4.根据权利要求1所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器，其特征在于：所述CRISPR-Cas12a系统中Cas12a蛋白与crRNA的摩尔浓度比优选为1:0.5。
5.根据权利要求1所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器，其特征在于：所述ssDNA的长度优选为81个核苷酸。
6.根据权利要求1所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤；
7.根据权利要求6所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器的制备方法，其特征在于：步骤S1中Fe-N
8.根据权利要求6所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器的制备方法，其特征在于：步骤S1中Fe-Co磁性纳米颗粒的制备包括，将Co(NO3)2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O和2-甲基咪唑混合，搅拌并冷冻干燥，所得前驱体在900℃下热解2小时，得到Fe-Co磁性纳米颗粒。
9.根据权利要求1所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器的检测方法，其特征在于：包括以下步骤；
10.根据权利要求9所述的一种无需扩增的AFB1适配传感器的检测方法，其特征在于：步骤S6中磁分离的具体条件为，将反应液置于外加磁场中，使Fe-Co磁性纳米颗粒与纳米复合物结合并沉降，随后移去上清液并洗涤，再将上清液转移至新的反应管中进行后续的TMB显色反应。
...【技术特征摘要】
1.一种无需扩增的afb1适配传感器，其特征在于：包括fe-n-c单原子纳米酶、fe-co磁性纳米颗粒、黄曲霉毒素（afb1）适配体和crispr-cas12a系统；
2.根据权利要求1所述的一种无需扩增的afb1适配传感器，其特征在于：所述fe-n-c单原子纳米酶中fe原子优选通过n原子与c骨架配位形成fe-nx活性位点。
3.根据权利要求1所述的一种无需扩增的afb1适配传感器，其特征在于：所述fe-co磁性纳米颗粒的直径优选为600nm。
4.根据权利要求1所述的一种无需扩增的afb1适配传感器，其特征在于：所述crispr-cas12a系统中cas12a蛋白与crrna的摩尔浓度比优选为1:0.5。
5.根据权利要求1所述的一种无需扩增的afb1适配传感器，其特征在于：所述ssdna的长度优选为81个核苷酸。
6.根据权利要求1所述的一种无需扩增的afb1适配传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤；
7.根据权利要求6所述的一种无需扩增的afb1适配传感器的制备方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯长军，马懿，刘美林，罗惠波，霍丹群，
申请(专利权)人：四川轻化工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。