【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析化学领域，具体地，涉及基于单发夹dna响应系统和共价有机框架的电化学生物传感器检测凝血酶的方法。
技术介绍
1、临床表现为动脉血栓、静脉血栓栓塞和弥散性血管内凝血的肿瘤相关血栓形成，是导致肿瘤患者死亡的第二大原因。凝血酶(thr)是一种参与凝血级联反应的丝氨酸蛋白酶，在促进癌症生长、转移和癌症相关血栓的形成中发挥重要作用。在健康个体中，血液中几乎不存在thr，但当癌症发生时，特别是恶性肿瘤，凝血系统可能会异常活跃并产生thr。在此过程中产生的thr浓度范围从1×10-9m(0.1u ml-1)到超过500×10-9m(50u ml-1)，这将导致癌症恶化和癌症相关血栓的形成。因此，准确监测癌症患者血液中低丰度thr的含量对防止癌症恶化并降低癌症死亡率具有重要意义。
2、近年来，采用抗体或适配体等高特异性识别元件，发展直接检测thr的生物传感器成为研究热点。在各种高选择性的生物识别元件中，适配体由于其高特异性、稳定性和灵敏性被公认为是非常有前景的生物受体，已被广泛用作生物传感器中的识别元件。在临床研究中，thr与其适配体的高特异性结合是最常用和密集使用的模型系统，已被证明基于适配体的亲和力测试是可行的。目前，应用于thr检测的方法主要有光学法和电化学法。比色法和荧光法因其在检测的便捷性和实时性等方面的优势而被广泛应用，但存在探针标记步骤复杂耗时、背景噪声高、难以准确定量等主要挑战。相比之下，电化学方法在免标记、定量测量、灵敏检测等方面具有优势，但已报道的电化学生物传感器仍存在一定的局限性，如需要复杂的
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的问题，并提供一种基于sahrs响应系统和cof信号放大的电化学生物传感器。
2、本专利技术的另一目的是提供利用该电化学生物传感器检测凝血酶的方法。
3、本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
4、以凝血酶为靶标的单发夹dna响应系统，单发夹dna序列为：5′-sh-aaaaaaaaaaggcagttggttggtgtggttggtactgcc-biotin-3′，其中，5′端sh表示巯基，用于与电沉积在电极上的aunps形成au-s键，将单发夹dna响应系统修饰在电极表面；3′端biotin是一种生物素用于特异性识别链霉亲和素sa。所述单发夹dna可以被thr触发构像变化，形成sa的适体结构。
5、一种基于单发夹dna响应系统和共价有机框架的电化学生物传感器，包含修饰本专利技术所述的单发夹dna响应系统的电极dpau/gce@sahrs，以及sa修饰的共价有机框架tph-tapm cof@sa。所述共价有机框架是一种具有优异电子转移性能的n-型半导体。
6、作为本专利技术的一种优选，所述的dpau/gce@sahrs电极具体通过以下方法制备得到：
7、(1)使用氧化铝悬浮液抛光玻碳电极gce，然后用纯水和乙醇进行超声处理；
8、(2)将清洁的gce置于1％～3％haucl4溶液中，然后在-0.2v的电势下在电极上电沉积金纳米颗粒20～50s,得到金纳米颗粒改性电极dpau/gce；
9、(3)将所述的单发夹dna响应系统sahrs溶液滴加在dpau/gce电极上，孵育一段时间，使其通过au-s键连接到电极表面，反应完后用pbs冲洗电极表面，以除去未反应的sahrs，
10、(4)用1％的bsa终止dpau/gce表面，得bsa封端的dpau/gce@sahrs电极。
11、作为本专利技术的进一步优选，所述单发夹dna响应系统sahrs溶液滴加在dpau/gce电极上，孵育时间为10～60min，优选的，孵育时间为40min。
12、作为本专利技术的进一步优选，所述的sahrs溶液的浓度为1～5μm，优选2μm。
13、作为本专利技术的进一步优选，所述的共价有机框架tph-tapm cof@sa主要通过以下制备方法制得：
14、(a)在派热克斯耐热玻璃管内，将4,4',4”,4”'-(芘-1,3,6,8-四基)四苯甲醛tapm和5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21h,23h-卟啉tph超声分散于均三甲苯和1,2-二氯苯的混合溶液中，然后加入乙酸溶液，并超声处理10～15min，得到前驱体混合液；
15、(b)在77k液态n2浴下快速冷冻派热克斯耐热玻璃管，并通过三次冷冻泵-解冻循环脱气，获得均匀分散的前驱体溶液和真空反应体系，然后，进行真空密封在温度为110～130℃下反应70～80h，获得灰色沉淀tph-tapm cof；
16、(c)过滤收集tph-tapm cof，在用四氢呋喃彻底清洗24h，然后120℃干燥12h，获得tph-tapm cof粉末；
17、(d)制备tph-tapm cof@sa：在无酶管内将tph-tapm cof和链霉亲和素sa混合均匀后，于0～4℃下搅拌反应6～10h,获得共价有机框架tph-tapm cof@sa。
18、作为本专利技术的进一步优选，tapm和tph之间的质量比为1:1～1.5，优选25:27。
19、作为本专利技术的进一步优选，tph-tapm cof和sa的搅拌反应时间为8h。
20、一种利用本专利技术所述的基于单发夹dna响应系统和共价有机框架的电化学生物传感器检测凝血酶thr的方法，所述的方法包括：
21、(1)标曲制作：在37℃下，将5μl不同浓度的thr滴加在权利要求2～7中任一项所述的dpau/gce@sahrs电极表面，孵育一段时间，使其触发sahrs构像变化，结束后用0.01m pbs除去未参与反应的thr，这一步获得的电极标记为:dpau/gce@sahrs@thr电极；将tph-tapmcof@sa滴加到dpau/gce@sahrs@thr电极上，在37℃下温育30min；将修饰电极置于含有对苯二酚hq的0.01m pbs缓冲液中，测试不同浓度thr对应的电化学差示脉冲伏安法响应，电压范围为0.0～0.5v，获得标准曲线；
22、(2)样品检测：将未知浓度的thr样品替代步骤(1)中不同浓度的thr，按照步骤(1)中的方法检测，测得dpv信号，代入步骤(1)制做的标准曲线计算出样品中thr浓度。
23、作为本专利技术的一种优选，thr在dpau/gce@sahrs电极表面孵育30～50min，优选孵育40min。
24、作为本专利技术的一种优选，所述tph-tapm cof@sa的浓度为1mg/ml，滴加到电化学生物传感器中的用量为5μl。
25、作为本专利技术的一种优选，所述0.01m pbs缓冲液中对苯二酚hq的浓度为80～200μg/ml，优选的，hq本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.以凝血酶为靶标的单发夹DNA响应系统，其特征在于，单发夹DNA序列为：5′-SH-AAAAAAAAAAGGCAGTTGGTTGGTGTGGTTGGTACTGCC-biotin-3′，其中，5′端SH表示巯基，用于与电沉积在电极上的AuNPs形成Au-S键，将单发夹DNA响应系统修饰在电极表面；3′端biotin是一种生物素用于特异性识别链霉亲和素SA。
2.一种基于单发夹DNA响应系统和共价有机框架的电化学生物传感器，其特征在于，包含修饰权利要求1所述的单发夹DNA响应系统的电极DpAu/GCE@SAHRS电极，以及SA修饰的共价有机框架TPH-TAPM COF@SA。
3.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的DpAu/GCE@SAHRS电极具体通过以下方法制备得到：
4.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述单发夹DNA响应系统SAHRS溶液滴加在DpAu/GCE电极上，孵育时间为10～60min，优选的，孵育时间为40min。
5.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的S
6.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的SA修饰的共价有机框架TPH-TAPM COF@SA主要通过以下制备方法制得：
7.根据权利要求6所述的电化学生物传感器，其特征在于TAPM和TPH之间的质量比为1:1～1.5，优选25:27。
8.一种利用权利要求2～7中任一项所述的基于单发夹DNA响应系统和共价有机框架的电化学生物传感器检测凝血酶Thr的方法，其特征在于，所述的方法包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，Thr在DpAu/GCE@SAHRS电极表面孵育30～50min，优选孵育40min。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述TPH-TAPM COF@SA的浓度为1mg/mL，滴加到电化学生物传感器中的用量为5μL。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述0.01M PBS缓冲液中对苯二酚HQ的浓度为80～200μg/mL，优选的，HQ的浓度为100μg/mL；所述的PBS缓冲液的pH值为6.0～8.5，优选的，PBS缓冲液的pH值为7.4。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，凝血酶的浓度范围为0～20nM，测定HQ的DPV电压为0～0.5V。
13.权利要求1所述的单发夹DNA响应系统、权利要求2～7所述的基于单发夹DNA响应系统和共价有机框架的电化学生物传感器在测定凝血酶中的应用。
...【技术特征摘要】
1.以凝血酶为靶标的单发夹dna响应系统，其特征在于，单发夹dna序列为：5′-sh-aaaaaaaaaaggcagttggttggtgtggttggtactgcc-biotin-3′，其中，5′端sh表示巯基，用于与电沉积在电极上的aunps形成au-s键，将单发夹dna响应系统修饰在电极表面；3′端biotin是一种生物素用于特异性识别链霉亲和素sa。
2.一种基于单发夹dna响应系统和共价有机框架的电化学生物传感器，其特征在于，包含修饰权利要求1所述的单发夹dna响应系统的电极dpau/gce@sahrs电极，以及sa修饰的共价有机框架tph-tapm cof@sa。
3.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的dpau/gce@sahrs电极具体通过以下方法制备得到：
4.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述单发夹dna响应系统sahrs溶液滴加在dpau/gce电极上，孵育时间为10～60min，优选的，孵育时间为40min。
5.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的sahrs溶液的浓度为1～5μm，优选2μm。
6.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的sa修饰的共价有机框架tph-tapm co...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。