【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞培养，尤其涉及一种子宫内膜干细胞的制备方法。
技术介绍
1、干细胞是指在一定条件下可以无限自我更新和增殖分化的细胞，包括从胚胎发育到成人生长发育过程中各种未分化的细胞。从受精卵到胚胎发育，直至最终衰老死亡的整个生命过程中都贯穿干细胞的存在、自我更新和发育分化；
2、干细胞的取材方法现在多采用酶消化法，酶消化法的做法主要是利用胰蛋白酶、胶原酶或中性蛋白酶等在33℃下处理消化组织，将获得的细胞接种于培养皿上培养，酶消化法虽然能获得较多细胞，但是干细胞的纯度较低，如何提高纯度是需要解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种子宫内膜干细胞的制备方法，旨在解决的问题。
2、本专利技术是这样实现的，一种子宫内膜干细胞的制备方法，包括如下步骤：
3、1）在无菌条件下取得离体的子宫内膜组织，进行预处理；
4、2）将预处理后的子宫内膜组织放入装有细胞培养液的石英玻璃培养容器中，采用长波紫外线照射处理5-10min；
5、3）将紫外线照射处理后的子宫内膜组织在氧浓度为1-5%的低氧环境下培养4-5h；
6、4）将低氧培养后的子宫内膜组织用无菌d-hanks溶液清洗2次，然后与胰蛋白酶消化液混合进行一次消化，过滤得到一次滤液和一次消化后的子宫内膜组织；
7、5）将一次消化后的子宫内膜组织剪成1-2mm3碎块，与二次消化液混合进行二次消化，经200-300目的滤网过滤，得到二次滤液和二次消化
8、6）将一次滤液和二次滤液合并以1300-1600r/min离心，收集细胞，用hbss液冲洗细胞3次，与培养基混合后接种至培养容器中培养，每隔2-4天更换新鲜的培养基。
9、通过紫外线照射和低氧培养，子宫内膜组织会发生应激反应，子宫内膜组织中的基质细胞和上皮细胞均为成熟分化细胞，不具备抵抗应激反应的能力，活性降低，发生凋亡或坏死，子宫内膜干细胞具备核质比大，更新周期慢等特点，可以抵抗应激，不发生凋亡，有利于子宫内膜干细胞得到维持和保存，实现去除其他成熟分化细胞，再通过低氧培养提高干细胞的存活率和增殖能力，并保持干性，筛选效率高，筛选细胞纯度高。
10、优选地，所述预处理为采用1％的生理盐水和0.9％的抗生素对子宫内膜组织进行浸泡漂洗，浸泡漂洗完成后采用d-hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗2次。
11、优选地，所述抗生素为青霉素-链霉素双抗。
12、优选地，所述紫外线照射处理采用照射处理设备，所述照射处理设备包括：
13、工作台；
14、转动安装于工作台上的旋转台，用于放置石英玻璃培养容器，所述工作台上固定有用于带动旋转台转动的第一步进电机；
15、位于工作台上且罩设于旋转台外部的带有夹层的石英玻璃罩，所述夹层用于充入臭氧；
16、设于石英玻璃罩外部的紫外灯；
17、用于带动紫外灯沿弧形轨迹运动的运动结构。
18、优选地，所述石英玻璃罩上连接有与夹层连通的气管，所述气管与臭氧发生器连接，所述气管上连接有支管，所述支管上安装有阀门。
19、优选地，所述运动结构包括：
20、固定于工作台上且位于石英玻璃罩外侧的第二步进电机，可通过螺丝固定；
21、一端与第二步进电机输出轴固定的安装板，可通过螺丝固定，所述安装板位于石英玻璃罩外侧且另一端延伸至石英玻璃罩顶部上方；
22、竖直固定于安装板另一端的电动推杆，所述电动推杆的伸缩端朝下且固定有紫外灯，可通过螺丝固定。
23、优选地，所述一次消化和二次消化为在37℃的恒温振荡仪中消化30-60min。
24、优选地，所述二次消化液包括2-3mg/ml的i型胶原酶和1-2mg/ml透明质酶。
25、优选地，所述培养基以dmem培养基为基础，还包括质量百分比为15-25%的血小板裂解物、浓度为3-5mm的谷氨酰胺、浓度为2-4ug/ml的槲皮素、1-3ug/ml芍药苷、体积分数为1-3％青霉素-链霉素双抗溶液。
26、优选地，所述血小板裂解物为将血小板经过超声处理后得到。
27、血小板裂解物含有天然的营养成分，且血小板裂解物是血小板经过超声裂解，使得血小板的内含物质分裂成基础成分，更容易被细胞利用，槲皮素和芍药苷协同配合，协助干细胞抗氧化应激、抵抗体外培养环境压力，提高细胞增殖、细胞活率、细胞纯度，本专利技术的培养基有利于胚胎干细胞的生长，具有胚胎干细胞生长所需的营养成分，使得胚胎干细胞能在体外快速分裂增殖，有效避免胚胎干细胞在体外培养过程中出现分化，使得子宫内膜干细胞这类型较为成熟的胚胎干细胞能够保持原有的干性，迅速分裂增殖，细胞纯度高。
28、与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：
29、本专利技术所提供的子宫内膜干细胞的制备方法通过紫外线照射和低氧培养，实现去除子宫内膜中其他成熟分化细胞，保留子宫内膜干细胞的目的，提高干细胞的存活率和增殖能力，并保持干性，筛选效率高，筛选细胞纯度高。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述预处理为采用1％的生理盐水和0.9％的抗生素对子宫内膜组织进行浸泡漂洗，浸泡漂洗完成后采用D-hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗2次。
3.如权利要求2所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述抗生素为青霉素-链霉素双抗。
4.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述紫外线照射处理采用照射处理设备，所述照射处理设备包括：
5.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述石英玻璃罩上连接有与夹层连通的气管，所述气管与臭氧发生器连接，所述气管上连接有支管，所述支管上安装有阀门。
6.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述运动结构包括：
7.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述一次消化和二次消化为在37℃的恒温振荡仪中消化30-60min。
8.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的
9.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基以DMEM培养基为基础，还包括质量百分比为15-25%的血小板裂解物、浓度为3-5mM的谷氨酰胺、浓度为2-4ug/ml的槲皮素、1-3ug/ml芍药苷、体积分数为1-3％青霉素-链霉素双抗溶液。
10.如权利要求9所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述血小板裂解物为将血小板经过超声处理后得到。
...【技术特征摘要】
1.一种子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述预处理为采用1％的生理盐水和0.9％的抗生素对子宫内膜组织进行浸泡漂洗，浸泡漂洗完成后采用d-hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗2次。
3.如权利要求2所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述抗生素为青霉素-链霉素双抗。
4.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述紫外线照射处理采用照射处理设备，所述照射处理设备包括：
5.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，所述石英玻璃罩上连接有与夹层连通的气管，所述气管与臭氧发生器连接，所述气管上连接有支管，所述支管上安装有阀门。
6.如权利要求4所述的子...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏俊鹏，贺明峰，
申请(专利权)人：浙江杭科细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。