眼虫藻Δ８脱氢酶的核苷酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种从眼虫藻中分离的编码Δ８脱氢酶的核苷酸序列及其应用。它是ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１所示的核苷酸序列或编码ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：２所示的氨基酸序列的核苷酸序列及其多肽。本发明专利技术包括编码Δ８脱氢酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行功能性表达的重组表达载体以及含有本发明专利技术重组表达载体的酵母细胞、霉菌细胞及其后代细胞。用上述的核苷酸序列或多肽序列或含有本发明专利技术重组表达载体的酵母细胞、霉菌细胞及其后代生产多不饱和脂肪酸的方法以及用上述的核苷酸序列或多肽序列用于转基因植物生产多不饱和脂肪酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
眼虫藻^8脱氢酶的核苷酸序列及其应用
本专利技术属于生物和遗传工程
，涉及从一种眼虫藻 (E. gracilis)中克隆A 8脱氢酶基因，具体讲是眼虫藻A 8脱氢酶的核苷酸序列及其应用。 将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码A8 脱氢酶产生多不饱和脂肪酸的方法和应用。
技术介绍
:多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)是指含有两 个或两个以上顺式双键、碳原子数为16至22的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸是以多种形 式存在于细胞中如细胞膜、储存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作为生物膜结构中磷 脂的重要成分之一，PUFAs的种类、数量、饱和度的改变会直接影响生物膜的刚性结构，因此 影响了与刚性结构相关的各种生理功能。经过研究发现PUFAs与包括心血管疾病，糖尿病、 关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎在内的多种慢性疾病相关，并且可以通过影响细胞的增殖和 信号传导途径来影响癌症的发生和发展情况。最近的研究表明，PUFAs还能影响骨骼的生 长与修复过程。不仅如此PUFAs还能作为一种重要的生理活性物质影响胎儿的发育。因此 PUFAs的生物合成以及合成途径中的一些关键酶受到广泛的关注。 PUFAs的合成主要是由碳链的延长和脱氢两个主要反应组成，合成的最初底物 是饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸。为了适应不同的自然界环境，不同的物种在基本的合成 途径基础之上又衍生出了各种不同PUFAs合成机制。除了传统的n-6和n-3两类不同的 多不饱和脂肪酸途径外，在藻类等微生物中又发现了第三种分支合成途径，即八9延长酶 途径亚油酸(LinoleicAcid， LA， C18:2n-6， A9，12)或a亚麻酸(a-LinolenicAcid， ALA， C18:3n-3， ) A 9， 12， 15) A 9延长酶的催化下生成EDA (EicosadienoicAcid， EDA， C20:2n-6， A11，14)和EtrA(EicosatrienoicAcid， EtrA， C20:3n-3， A 11， 14， 17)，然后 通过A8脱氢酶生成DGLA(Dihomo-Y-LinolenicAcid， DGLA， C20:3n-6， A8，11，14)和 ETA(EicosatetraenoicAcid， C20:4n-3， A 8， 11， 14， 17)，再进入n_6和n_3合成途径，经一 系列的碳链延长和脱氢反应合成花生四烯酸(Arachidonic acid，AA. C20:4n-6， A 5， 8， 11， 14) 、二十碳五烯酸(Eicos即entaenoic acid，EPA. C20:5n-3， A5，8， 11， 14， 17)和二十二碳 六烯酸(Docosahexaenoic acid， DHA. C22: 6n_3， A 4， 5， 8， 11， 14， 17)等有生物活性的长链 多不饱禾口月旨肪酸(Xong-chain polyunsaturated fatty acids， 1X-PUFAs)。包括a _亚麻 酸在内的多不饱和脂肪酸在保健和医疗方面有很广阔的应用前景。研究不饱和脂肪酸的合 成和它的生理作用成为当前的热点之一。A8脱氢酶的克隆对于PUFAs的合成和应用研究 具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供从眼虫藻中分离的编码A8脱氢酶的核苷 酸序列或其核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。从一种眼虫藻中克隆A8脱氢酶基因，具 体讲是眼虫藻A8脱氢酶的核苷酸序列及其应用。 本专利技术的目的之二是提供该核苷酸序列所编码的A8脱氢酶多肽、或其片段、类 似物或衍生物。 本专利技术的目的之三是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能 性表达的重组表达载体。3 本专利技术的目的之四是提供含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调 节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代。 本专利技术的目的之五是提供一种用含有该基因核苷酸序列、或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞、或该核苷酸序列所编码的A8脱氢酶多肽制备多不饱和脂肪酸的方法。 本专利技术第一方面提供的是SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。 分离的A8脱氢酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选 自下组的一种核苷酸序列相同或相似(l)具有编码SEQ ID N0:2氨基酸序列的活性多肽 的核苷酸序列；(2)与核苷酸序列(1)互补的核苷酸序列。准确地，该核苷酸序列具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。 本专利技术的第二方面，提供分离的上述核苷酸序列所编码的多肽，该多肽是具有SEQ ID N0:2氨基酸序列的多肽。 编码SEQ ID NO :2活性多肽的核苷酸序列包括只有成熟多肽的编码序列；成熟 多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以 及非编码序列。 本专利技术的核苷酸序列可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组 DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编 码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID N0:2所示的编码区序列相同或是简并的变异体。 本专利技术还提供了一种新的多肽序列_眼虫藻A8脱氢酶的氨基酸序列，其基本上 是由SEQ IDN0:2所示的氨基酸序列组成。本专利技术的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成 多肽，优选重组多肽。本专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用 重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物)细胞中产生。 本专利技术的第三方面，提供了含有上述核苷酸序列的质粒或病毒重组表达载体，特 别是pYES2. O-EFD或其他重组表达载体。 本专利技术的第四方面，提供了被上述核苷酸序列或质粒或病毒重组表达载体转化的 宿主细胞及其后代细胞。这些宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，以 及酵母细胞、霉菌细胞及这些宿主细胞的后代。 本专利技术的第五方面，提供了一种用含有该基因的核苷酸序列、或该基因核苷酸序 列与异源调节序列连接的质粒或病毒重组表达载体转化或转导宿主细胞及其后代细胞、或 用该核苷酸序列所编码的A8脱氢酶多肽制备不饱和脂肪酸的方法。 本专利技术的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 本专利技术所涉及的技术术语的含义分离的是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是 天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列和多肽是没有分离纯化的，但同 样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。 分离的核苷酸序列是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其 它物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化的。眼虫藻A 8脱氢酶的核苷酸序列是指包括编码眼虫藻A 8脱氢酶多肽的核苷酸4序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列。简并的变异体在本专利技术中是指编码具有SEQ ID N0:2的蛋白质或多肽，但与SEQID NO:l所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Δ８脱氢酶的核苷酸序列，其特征在于它是ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的核苷酸序列或与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
一种Δ8脱氢酶的核苷酸序列，其特征在于它是SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或与SEQID NO1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2. 按照权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是选自下组(a) 编码具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；(b) 与核苷酸序列(a)互补的核苷酸序列；(c) 核苷酸序列(a)的核苷酸突变序列。3. —种多肽，其特征在于它是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。4. 一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒 所构建的重组表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明春，黎明，魏东盛，欧秀元，邢来君，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]