本发明专利技术提供一种香蕉线条病毒ＰＣＲ检测引物及其检测试剂盒，其中，其上游引物５′－ＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣ－３′，下游引物５′－ＡＧＴＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣ－３′。利用本发明专利技术试剂盒进行检测，能大大降低交叉污染的机率，又使检测效率大幅度提高，同时检测灵敏度也非常高，操作简单方便，防止交叉污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测香蕉线条病毒的引物及其检测试剂盒。
技术介绍
香蕉是中山市水果业的支柱产业和重要的出口农产品，远销日本，在日本市场有着 良好的口碑，年出口值约十万美元。目前香蕉病毒病一直是我国香蕉生产和香蕉组培苗 出境的主要限制因素之一，近年来，香蕉病毒病对中山市的香蕉产量和质量也产生了严 重的影响，已成为中山市香蕉产业发展的主要限制因素之一。另外，香蕉一旦被病毒侵 染，很难用药剂防治。对付香蕉病毒病，最有效的措施就是预防为主。出于对进口食品 检疫安全的关注，日本厚生劳动省几次派员来中山视察香蕉生产情况。而对香蕉种苗特 别是对香蕉组培苗的病毒早期检测已经成为控制香蕉病毒病发生蔓延和保障其顺利出境 的非常有效的措施。综合上述情况，我们认为有必要在中山市开展香蕉病毒病的普查工 作和相关的快速检测技术研究工作，这些工作的开展必将为中山市香蕉产业健康发展做 出积极的贡献。香蕉病毒病一直是我国香蕉大田生产和香蕉组培苗出境的主要限制因素之一。近年 来，香蕉病毒病对中山市的香蕉产量和质量都产生了比较严重的影响，也己成为中山市 香蕉产业发展的主要障碍之一。为了保障中山市香蕉产业可持续健康的发展，中山出入 境检验检疫局利用人才和仪器优势资源，首次对中山市主要香蕉生产基地进行了病毒病 普查并对本市香蕉主要病毒进行了分子检测方法的相关研究。按照不同生长季、不同品 种迸行采样，分别于2007年4 5月、10 11月和2008年4 5月、10 11月间，先后 到民众镇、火炬开发区、横栏镇、南朗镇、坦洲、黄圃镇和五桂山镇等香蕉主要生产区 镇的香蕉生产基地进行大面积的实地调査和样品采集，调査面积约为1000亩左右，并通 过对蕉农咨询来了解香蕉病毒病历年发生与危害的情况，调査和采样的香蕉种类有香 蕉、粉蕉和大蕉，共采集花叶、褪绿、矮縮等病毒症状的可疑样品200份。对采集的样 品首先采用血清学方法进行筛选检测，主要是通过ELISA方法；然后根据ELISA检测结 果，对阳性结果和可疑结果样品再用现代分子生物学方法如PCR检测法进行针对性检测， 尤其是对ELISA检测呈阳性反应的样品进行重点检测和确证，最后再对血清学检测和分 子检测都为阳性的样品结果进行核酸序列测定，以便对病毒种类进行终级判定。综合血 清学、PCR和序列分析检测结果，发现中山市侵染香蕉的主要病毒种类有三种，它们分3别是香蕉束顶病毒(BBTV)，总BBTV病样100个(86.2% );香蕉花叶心腐病毒(CMV)， 总CMV病样26个(22.4%);香蕉线条病毒(BSV)，总BSV病样10个(8.6%)。另外，我们对血清学检测和PCR检测都为阳性的样品进行克隆并进行核酸序列测 序首先采用载体pGEM-T进行克隆，构建重组质粒然后采用抗生素和a—互补法筛 选重组质粒；经PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体及抽提并纯化质粒后，再利用 通用测序引物对重组质粒进行序列测定，分别得到三条序列，分别定名为CMV-ZS、 BSV-ZS禾Q BBTV-ZS 。经与GenBank中的核酸序列比发现所得序列的确分别来自黄瓜 花叶病毒CMV外壳蛋白基因、香蕉线条病毒BSV外壳蛋白基因和香蕉束顶病毒BBTV 复制酶基因；BBTV-ZS (中山分离物)与登陆号为AF246123的中国分离物同源性最高 为98.9%,与登陆号为AY222303及AM055641的印度分离物同源性最低为92.6%; CMV-ZS (中山分离物)与登陆号为AG585521的澳大利亚243株系同源性最高为98.9%， 与登陆号为CMO304397及CMO304397的ALS分离物同源性最低为69.1%; BSV-ZS(中 山分离物)与登陆号为DQ451009的中国广东分离物同源性最高为100%。BBTV是DNA病毒，目前，也有人用PCR检测香蕉线条病毒，但是其相关试剂盒 一般都是多步骤加入PCR试剂，不仅非常容易交叉污染，还费时费力，检测灵敏度也不 高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测香蕉线条病毒的引物及其检测试剂盒，用本专利技术试剂 盒进行检测，大大地简化了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染，能大大降低交叉污染 的机率，又使检测效率大幅度提高，同时检测灵敏度也非常高，操作简单方便，防止交 叉污染。本专利技术提供的技术方案是 一种用于检测香蕉线条病毒的PCR检测引物，其上游引 物5' -GGA ATG AAA GAG CAG GCC-3'，下游引物5' -AGT CAT TGG GTC AAC CTC TGT exes' c一种香蕉线条病毒检测的方法，包括如下步骤(1) 提取待测样品香蕉DNA，备用；(2) 利用所述的引物将第O)步提取的DNA进行PCR扩增；(3) 取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品是否呈阳性，若扩增条带的长 度为645bp，则待测样品呈阳性。上述的方法，第(1)步提取待测香蕉DNA的步骤如下1) 取待检测嫩叶片O. 1-0.2g，放置于1.5mL的离心管中，液氮冷冻；2) 通过振荡器剧烈振荡，用玻璃棒将叶片研碎；3) 加入O. 6mL CTAB提取缓冲液匀浆+2^ 2-ME，振荡混匀；4) 65。C温育30rain;再加入O. 5mL氯仿，混匀5rain;5) 12000rpm离心5min，上层水相移至一新的离心管中；6) 加入1X倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-2(TC放置30min;7) 12000rpm离心10min，弃去上清；8) 70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min;再用100%乙醇洗一次；9) 弃去上清，真空干燥5min;10) 沉淀溶于50uLTE (pH8.0)之中，-20保存备用。上述的方法，第(2)步中，PCR反应条件如下先94'C 3min变性；然后94°C 30sec，53°C lrain， 72°C lmin，35个循环；最后72。C 10min。一种用于检测香蕉线条病毒的试剂盒，包含所述的引物。所述的试剂盒中，还包括DNA聚合酶混合物(DNA Polymerase Mixture)，以及香 蕉线条病毒阳性对照(如可直接使用香蕉线条病毒，或者用所述引物扩增出来的片段)。一种用于检测香蕉线条病毒的的PCR反应体系，以总体积50 ul计，其包括DNA 聚合酶混合物(DNA Polymerase Mixture) 25 u 1，模板DM 50ng，浓度为50 u M的所 述的上游引物和下游引物各1U 1，余量为灭菌蒸馏水。本专利技术的具有如下优点利用本专利技术所述引物及其试剂盒检测香蕉线条病毒(BSV)， 阳性对照是含有专门从广东省中山市发病香蕉叶片中克隆出来的BSV基因的载体。只要 加入待检样品的核酸和本试剂盒中的BSV的一对引物，便可以进行PCR反应，大大地简化 了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染，同时使检测效率大幅度提高，检测灵敏度也非 常高，可以达到O. lpg;另外使用本制品扩增得到的PCK产物3'端还附有一个A碱基， 可直接克隆于T-Vector中。附图说明图1为PCR法检测香蕉线条病毒凝胶电泳图。其中，M: 100bp DNA marker: CK—，空白对照；CK + ,阳性对照；1 17， 待检 测样品。具体实施例方式实施例一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测香蕉线条病毒的ＰＣＲ检测引物，其特征在于：其上游引物５′－ＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣ－３′，下游引物５′－ＡＧＴＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣ－３′。
【技术特征摘要】
1、一种用于检测香蕉线条病毒的PCR检测引物，其特征在于其上游引物5′-GGAATGAAAGAGCAGGCC-3′，下游引物5′-AGTCATTGGGTCAACCTCTGTCCC-3′。2、 一种香蕉线条病毒的检测方法，包括如下步骤(1) 提取待测样品香蕉DNA，备用；(2) 第(1)步提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；(3) 取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品是否呈阳性，若扩增条带的长度为645bp，则待测样品呈阳性。3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于第(1)步提取待测香蕉DNA的步骤如下1) 取待检测嫩叶片0. l-0.2g,放置于1.5mL的离心管中，液氮冷冻；2) 通过振荡器剧烈振荡，用玻璃棒将叶片研碎；3) 加入0.6mL CTAB提取缓冲液匀浆+2。/。 2-ME，振荡混匀；4) 65。C温育30min;再加入...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈定虎，王龙贵，杨雷亮，管维，
申请(专利权)人：中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，陈定虎，王龙贵，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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